HPLC色谱柱对蛋白质和多肽的分析介绍.pdf

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1、色谱柱对蛋白质和多肽的分析目录Page１．序言--------------------------------------------1２．HPLC分离蛋白质、多肽-------------------------------1３．各种分离模式--------------------------------------4３－１．尺寸排阻模式---------------------------------4３－２．离子交换模式---------------------------------8（附录）缓冲液的种类-------

2、---------------------------16３－３．反相模式------------------------------------17３－４．疏水色谱模式---------------------------------23３－５．亲和模式--------------------------------------24３－６．复合模式-------------------------------------341.前言蛋白质・多肽的分离精制技术在医药品、食品等领域中的运用必不可少，这其中高效液相色谱仪HPLC发

3、挥着非常重要的作用。主要应用的分离模式有尺寸排阻、反相、离子交换、疏水色谱、亲和色谱这5类、而且还有尺寸排阻和反相（或离子交换）相结合的复合模式。本文首先对各种分离模式进行介绍，然后再介绍所对应的Shodex色谱柱的专有技术和分析实例。2.HPLC对蛋白质・多肽的分离建立分离精制计划，首先要明确对象试料的性质，然后选择最适合的分离模式。考虑选择什么样的分离模式时，首先要分析一下试料的性质。①目的成分和其它成分的分子量相差很大时→选择尺寸排阻模式②目的成分和其它成分的等电点相差1以上时→离子交换模式③目的成分和其它成分的疏水性有

4、差别时→反相模式、疏水性色谱模式④使用对目的成分有亲和作用的填充剂时→亲和模式⑤目的成分的pＨ、盐浓度以及温度稳定性以分析为目的时，参考上述的①～④分离模式进行选择一般就满足了。以制备为目的时，为避免所要成分性质发生变化，就需要对第⑤项内容进行确认了。通常几种分离模式组合起来进行逐步分离精制。图1表示了逐步分离的设计实例。未知样品的一次筛选选用在一定时间内从大分子量到小分子量按顺序洗脱的GFC色谱柱。图１：分离精制逐步实现的设计实例塩析脱塩イオン交換离子交换模式モード盐析脱盐（GFCまたは限外ろ過）（GFC或者超滤）アフィニテ

5、ィモード亲和模式疎水性クロマトモード疏水色谱模式サイズ排除尺寸排阻模式モードイオン交換离子交换模式モード有機溶媒画分有机溶剂アフィニティモード亲和模式サイズ排除尺寸排阻模式モード（脱有機溶媒）疎水性クロマトモード疏水色谱模式（脱有机溶剂）イオン交換离子交换模式モード疎水性クロマトモード疏水色谱模式等电点沉淀等電点沈殿サイズ排除尺寸排阻模式モードアフィニティモード亲和模式Shodex有用于蛋白质・多肽分析的上述分离模式的各种色谱柱。图2-1、2-2从对象试料的性质来选择最适合的色谱柱的标准表。各分离模式的特征在第3章说明。1图２

6、－１：Shodex色谱柱的选择方法（GFC、逆相）对应的Shodex色谱柱分离模式分離モード対応するShodexカラムMWタンパク質蛋白质GFCペプチド3KW-802.5,KW402.5多肽104KW-803,KW403105KW-804,KW40410106KW405107反相逆相MWRP18-413,RP18-613DE-413,DE-613LowODP-50,ODP-40C8P-50C4P-50HighRP18-4152图３：Shodex色谱柱的选择方法（离子交换、疏水性色谱、复合模式、亲和模式）分离模式分離モード対応す

7、るShodexカラム对应的shodex色谱柱蛋白质PIタンパク質イオン交換离子交换3ペプチドQA-825DEAE-825DEAE3N-4TES-502N多肽579SP-825SP-420NCM-825ES-502C11疎水性クロマト疏水性色谱PH-814MWマルチモード复合模式2GS-220HQ1010３GS-320HQGS-520HQ10４GS-620HQ10５10６亲和色谱アフィニティAFpakseries3.各种分离模式33-1.尺寸排阻模式3-1-1.分离的原理SEC是利用溶液中的样品分子的形状（三元空间的占有体积）越

8、大越早洗脱出来的原理（图３）来分离的。图３：尺寸排阻模式的原理(SEC:（SEC:SizeExdusionChromatographySizeExclusionChromatography)）充てん剤填充剂最大尺寸一番大きな物质化合物最小尺寸物质一番小さな化合物排除限界容量排