米氏凯伦藻三种无机氮源的生长情况.doc

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米氏凯伦藻在三种无机氮源的生长情况吕颂辉1，黄凯旋21.暨南大学赤潮与水环境研究中心，广东广州510632；2.暨南大学水生生物研究中心，广东广州510632摘要：米氏凯伦藻引发的赤潮危害鱼类和无脊椎动物，给养殖业带来严重的经济损失，研究其营养生理生态，对掌握该藻形成赤潮的规律有着重要的意义。采用一次培养的实验方法研究了米氏凯伦藻（KareniamikimotoiHansen）在三种无机氮源不同氮磷浓度比(cN/cP)下的生长情况。结果表明：在分别以氯化铵、硝酸钠和亚硝酸钠为氮源时，米氏凯伦藻生长的最适cN/cP比分别为32、32和100。米氏凯伦藻对氯化铵的利用效率相对低于硝酸钠和亚硝酸钠，以氯化铵为氮源该藻生长缓慢，细胞密度低；而分别以硝酸钠和亚硝酸钠为氮源时该藻生长情况较好，可较长时间维持高的细胞密度。关键词：米氏凯伦藻；氯化氨；硝酸钠；亚硝酸钠；氮磷浓度比中图分类号：X17文献标识码：A文章编号：1672-2175（2007）05-1337-05米氏凯伦藻(KareniamikimotoiHansen)属于裸甲藻目（Gymnodiniales），凯伦藻属（Kerenia），它能分泌溶血性毒素和鱼毒素，有溶解鱼类鳃组织细胞的作用。中毒鱼鳃出现鳃小叶上皮细胞增生、邻近鳃小叶粘连、上皮细胞脱落、鳃血管破裂、血细胞渗出等组织病理现象。鳃小叶作为鱼类呼吸系统的重要组成部位，一旦发生上述病变，必将影响到鳃的呼吸、分泌、排泄等功能，最终造成鱼类的死亡。米氏凯伦藻分布广泛，是近年来常见的赤潮生物，并且已经在澳大利亚、北欧各国、日本、新西兰、南美、北非、我国香港等地引发过赤潮灾害，造成了严重的渔业经济损失[1，2]。1998年3至4月份，大鹏湾、深圳湾、珠江口及内伶仃岛一带海域和香港海域发生的大规模米氏凯伦藻赤潮，导致深圳经济损失超过千万人民币，香港渔农损失超过3亿港元[3，4]。研究米氏凯伦藻的营养生理，掌握其形成赤潮的规律，对于减少水产养殖业损失，保护海洋生态环境，有着重要的实际意义。有害赤潮的发生是物理、化学、生物和气候等多方面因素综合作用的结果，在众多要素中，营养盐是赤潮发生的首要物质基础，因此研究营养盐在赤潮发生和演替中的作用对探究赤潮的成因和防治具有重要的理论意义和实用价值[5]。本文选取的营养盐为无机氮源，以观察藻种种群的生长周期为主，研究不同无机氮源下米氏凯伦藻的生长特性。无机氮是海洋浮游植物生长繁殖必不可少的营养元素，溶解态无机氮主要包括NH4-N、NO3-N、NO2-N。藻类不能直接利用Ｎ2，只能以NH4-N、NO3-N、NO2-N为氮源，单细胞藻类对各种氮源的利用具有不同特点，许多学者认为藻类最优先利用铵盐，然后是硝酸盐、尿素和亚硝酸盐。海水中氮磷的增加与赤潮的发生存在一定的关系，同时氮磷浓度含量的比率也是影响海洋浮游植物群落组成的重要因素之一，不同的氮磷浓度比影响藻类细胞的生长速率和细胞内物质的合成。海洋中的浮游植物按一定比例利用海水中的氮磷，这一恒定比例称为Redfield系数（cN/cP=16）。海水中营养盐摩尔比值偏离Redfield系数过高或过低，均可导致浮游植物的生长受到某一相对低含量元素的限制，并且不同的浮游植物有各自适合细胞生长繁殖的最佳氮磷浓度比。根据Redfield系数，藻类在生长时按16：1的比例吸收海水中的氮磷，也有研究表明规范的Redfield系数并不是适合于所有浮游植物，不同浮游植物利用氮磷的比例存在一定差别[6-9]。为了解米氏凯伦藻氮营养生理特征，本文在实验室条件下采用一次培养的方法，研究米氏凯伦藻在不同无机氮源（NH4-N、NO3-N、NO2-N）及不同氮磷比下的生长情况。1材料与方法1.1实验藻种米氏凯伦藻(KareniamikimotoiHansen)分离自南海赤潮高发海域，经纯化后保存于暨南大学赤潮与水环境研究中心藻种室。实验前将处于对数生长期的实验藻种离心，用无氮无磷的f/2培养基培养2天后再接种。1.2培养条件氮营养实验所用的器皿均以5％的HCl浸泡过夜，超声波洗涤机清洗后以去离子水反复冲洗，灭菌后备用。其余实验所用的器皿用自来水洗净后，以蒸馏水反复冲洗，灭菌后备用。培养基采用外海天然海水，按照不含硅酸盐的f/2配方配制，其中氮、磷浓度按实验要求另加。培养基经121℃高压蒸汽灭菌20min后备用。培养温度为(25±1)℃，光照强度约为100µEm-2s-1，光暗比为12h∶12h。1.3实验方法以NaH2PO4﹒2H2O作为唯一磷源，NH4 -N、NO3-N、NO2-N分别作为氮源进行一次性培养实验。实验中设置初始磷浓度均为0.65μmol·L-1(根据赤潮高发区水域磷的平均值设定)，初始氮浓度依次为：0（对照组）、0.65μmol·L-1、2.60μmol·L-1、10.40μmol·L-1、20.80μmol·L-1、65.00μmol·L-1；使其氮磷浓度比分别为：0、1、4、16、32和100。每种氮源分为6个浓度梯度，每个浓度设两个平行样品。接种的初始密度约为500ｍL-1，培养液的总体积为30mL，用100mL的锥形瓶在培养箱进行培养。1.4测定和计算方法1.4.1细胞计数使用0.1mL浮游生物计数框，在OlympusCH30型双筒显微镜下进行细胞计数。自接种当天起，每2天在同一时间计数，得到单位培养液中的细胞密度值。1.4.2数据处理根据公式μ=(LnXt-LnXo)/△t求出比生长率，Xo表示初始细胞密度，Xt表示隔天后细胞密度。运用SPSS13.0软件对所得细胞密度均值进行多重比较统计分析（LSD法）。2结果2.1米氏凯伦藻在不同NH4-N浓度的生长情况图1不同NH4-N米氏凯伦藻的生长曲线Fig.1GrowthofK.mikimotoiatdifferentNH4-Nlevels以NH4-N为氮源，米氏凯伦藻在cN/cP为32和100时，细胞密度可以达到1×103ｍL-1的水平（图1），持续的时间分别为6d和4d。米氏凯伦藻细胞长18～37μm，宽14～35μm[10]，根据现有的赤潮评价标准[11]，此细胞大小的米氏凯伦藻其细胞密度达到1×103mL-1以上时，即可以形成米氏凯伦藻赤潮。cN/cP为100时细胞密度达到最高值的时间比cN/cP为32的延迟了3至4d，这可能与高浓度的铵盐有抑制藻类生长的作用有关。当cN/cP为1、4和16时，藻细胞密度增长不明显，生长平缓，较早进入衰亡期。图2显示，cN/cP为32时其比生长率0.27d-1为最大值。细胞密度均值统计分析表明：cN/cP为32时与对照组细胞密度差异极显著（P<0.01），且与cN/cP为1时存在差异（P<0.05）；cN/cP为100时与对照组细胞密度差异显著（P<0.05）。综合细胞密度和比生长率两个指标，以NH4-N为氮源，cN/cP为32时最适于米氏凯伦藻生长。图2不同NH4-N米氏凯伦藻的最大比率Fig.2SpecificgrowthrateofK.mikimotoiatdifferentNH4-Nlevels2.2米氏凯伦藻在不同NO3-N浓度的生长情况以NO3-N为氮源，不同浓度下米氏凯伦藻细胞密度都能达到1×103mL-1的水平，而且生长没有出现抑制现象，培养基加入NO3-N氮源后藻细胞在第4天即进入对数生长期，各生长曲线见图3。cN/cP为100时其比生长率0.41d-1为最高值，见图4。cN/cP为4的比生长率略高于cN/cP为16和32的，当其细胞密度达到最高值后，细胞密度一直下降，这可能与前4天米氏凯伦藻大量利用NO3-N，使得藻液中低浓度的N不足以提供藻细胞的继续生长和繁殖有关。相反，在cN/cP 比为16至100的培养中，细胞密度达到最大值后细胞密度仍可以保持在1×103mL-1的水平，持续的时间长达10d。细胞密度的均值分析显示：cN/cP为16时与对照组细胞密度差异显著（P<0.05）；cN/cP为32和100时与对照组细胞密度差异极显著（P<0.01）；1～100间的cN/cP细胞密度无差异（P>0.05）。以NO3-N为氮源，米氏凯伦藻在各浓度下都有较好的增长，细胞密度不存在差异。图3不同NO3-N浓度米氏凯伦藻的生长曲线Fig.3GrowthofK.mikimotoiatdifferentNO3-Nlevels图6不同NO2-N浓度米氏凯伦藻的最大比率Fig.6SpecificgrowthrateofK.mikimotoiatdifferentNO2-Nlevels2.3米氏凯伦藻在不同NO2-N浓度的生长情况图5不同NO2-N浓度米氏凯伦藻的生长曲线Fig.5GrowthofK.mikimotoiatdifferentNO2-Nlevels以NO2-N为氮源，最高的细胞密度出现在cN/cP为100的培养中，细胞数达到1.83×103mL-1（图5），最大比生长率为0.37d-1，略低于cN/cP为16的0.38d-1（图6）。cN/cP为16时，其细胞密度第4天即达到最高值，高于同期cN/cP为32和100的细胞密度，后两者细胞数达到最高值的天数分别为第6天和第8天，从中可以看出NO2-N较高的初始浓度反而不利于米氏凯伦藻生长，但是cN/cP为16时虽然比生长率最高，第4天后细胞数开始下降，可能NO2-N经米氏凯伦藻大量利用后，浓度已经有所下降，不足以再维持藻类大量的繁殖。而较高浓度的氮源浓度如cN/cP为100时，随着米氏凯伦藻逐渐利用NO2-N，其浓度下降到一定范围后更适于该藻的生长和繁殖。细胞密度均值分析显示：cN/cP为100时与对照组和cN/cP为1的细胞密度都存在极显著差异（P<0.01）,且与cN/cP为4的培养存在差异（P<0.05）；cN/cP为16时与对照组细胞密度差异极显著（P<0.01）；cN/cP为32时与对照组细胞密度差异明显（P<0.05）。以NO2-N为氮源，cN/cP为100时，米氏凯伦藻细胞增长明显。3分析与讨论图4不同NO3-N浓度米氏凯伦藻的最大比率Fig.4SpecificgrowthrateofK.mikimotoiatdifferentNO3-Nlevels本次实验应用一次培养的实验方法，研究了米氏凯伦藻在三种无机氮源的生长情况，各氮源和各浓度组的初始藻种都来源于同一生长状态的藻种，且细胞的初始密度都控制在(0.4～0.5)×103mL-1，另外由对照组（即不添加任何氮源）中藻细胞生长缓慢可以推测藻种经过无氮无磷的培养基培养2天后，细胞内的氮源对本实验的影响较小，由此米氏凯伦藻在三种氮源的生长情况具有一定的可比性。 从表1对米氏凯伦藻在三种无机氮源生长情况的比较发现，氯化铵对米氏凯伦藻的营养价值较其它两种无机氮源低，其最高的细胞密度和最大比生长率都是三者中最低，分别为1.25×103mL-1和0.272d-1。以氯化铵为氮源，最适于米氏凯伦藻生长的cN/cP为32，低于此值时细胞密度都小于1.0×103mL-1，高于此值时对藻类有抑制作用。以硝酸钠和亚硝酸钠为氮源，米氏凯伦藻增长明显，可较长时间维持高的细胞密度。表1米氏凯伦藻在三种氮源生长情况的比较Table1ThecoparisonofgrowthofK.mikimotoiwiththethreetypesofnitrogen氮源最适cN/cP最高细胞密度/(×103ml-1)最大比生长率/d-1NH4-N321.250.27NO3-N321.550.33NO2-N1001.830.37藻类利用铵盐时无需经过同化而可以直接利用，另外藻类在生长旺盛期大量吸收水中的碳酸根离子，导致培养基中pH值升高，铵盐作为一种生理酸性盐有助于降低pH值而利于藻类生长，一般认为单细胞藻类对铵盐的利用优于对硝酸盐和亚硝酸盐的利用，并有研究表明裸甲藻只少量吸收硝酸盐[12，13]。而在本实验中单独以铵盐作为氮源，米氏凯伦藻的生长情况不如于硝酸钠和亚硝酸钠。当氮源为氯化铵时，最适宜米氏凯伦藻生长的cN/cP为32，硝酸钠的为32，亚硝酸钠的为100。海洋中的浮游植物按一定比例自海水中吸收营养盐，也有研究表明，规范的Redfield系数并不是对各种浮游植物都适用，各种浮游植物最适生长的cN/cP不尽相同，浮游植物的cN/cP范围在8.2到45.0之间，而Redfield系数只是代表了它们的平均值[14]。不同种类的赤潮藻对营养盐有着各自的嗜好，有的观点认为快速生长的种类（如小型硅藻和小型鞭毛藻）在低cN/cP的水体中生长较好，而生长较慢的甲藻更适合生长于高cN/cP的水体中[15]。孙军[16]的研究结果显示，米氏凯伦藻在cN/cP为80的条件下比生长率最快，并认为该结果与国外学者的研究基本一致，即甲藻对氮的需求比较高。也有研究指出，浮游植物生长适宜的cN/cP范围与介质的营养水平有关，只有当海水中氮磷浓度均达到一定水平以上时候，氮磷浓度比对浮游植物才有实际意义，如果两者浓度均很低或者特别高，都可能导致浮游植物的生长受到某一相对低浓度元素的限制，而营养水平越高时，适宜的的范围则就越宽[6,17]。龙华等[18]通过现场调查也指出米氏凯伦藻的细胞密度与营养指数和磷酸盐浓度呈正相关性，高营养指数、丰富的磷酸盐含量和低氮磷比是米氏凯伦藻赤潮形成的重要条件。4结论本文通过比较米氏凯伦藻在三种无机氮源的生长情况发现：在分别以氯化铵、硝酸钠、亚硝酸钠为氮源时，米氏凯伦藻生长的最适cN/cP比分别为32、32和100，该藻对氮元素有较高需求。氯化铵作为氮源的营养价值相对低于硝酸钠和亚硝酸钠，生长于氯化铵氮源的米氏凯伦藻比生长率较小，增长缓慢，细胞密度不高；而以硝酸钠和亚硝酸钠为氮源，米氏凯伦藻增长明显且可较长时间维持高的细胞密度。参考文献：[1]王朝晖,尹伊伟,齐雨藻,等.珠海桂山岛米氏裸甲藻赤潮对鱼鳃损伤的病理学组织观察[J].海洋学报,2001,23(1):133-138.WANGZhaohui,YINYiwei,QIYuzao,etal.HistopathologicalchangesinfishgillsduringGymnodiniummikimotoiredtideinGuishanIslandarea,theSouthChinaSea[J].ActaOceanologicaSinica,2001,23(1):133-138.[2]YANGZB,HODGKISSIJ.Hongkong’sworst“redtide”:causativefactorsreflectedinaphytoplanktonstudyatPortShelterstationin1998.HarmfulAlgae,2004,3:149-161.[3]SONGHUILU,HODGKISSIJ.HarmfulalgalbloomcausativecollectedfromHongKongwaters[J].Hydrobiologia,2004,512:231-238.[4]张冬鹏,杨二俐,黄毅华.近年来深圳海域的赤潮及发展趋势[J].中国环境监测,2002,18(5):24-27.ZHANGDongpeng,YANGErli,HUANGYihua.StatusandtendencyofharmfulalgalbloomsinShenzhenwatersnearyears[J].EnvironmentalMonitoringinChina,2002,18(5):24-27.[5]韩秀荣,王修林,孙霞等.东海近海海域营养盐分布特征及其与赤潮发生关系的初步影响[J].应用生态学报,2003,14(7):1097-1104.HANXiurong,WANGXiulin,SUNXia,etal.NutrientdistributionanditsrelationshipwithoccurrenceofredtideincoastalareaofEastChinaSea[J].ChineseJournalofAppliedEcology,2003,14(7):1097-1104.[6]李铁,胡立阁,史致丽.营养盐对中肋骨条藻和新月菱形藻生长及氮磷组成的影响[J].海洋与湖沼,2003,31(1):46-52.LITie,HULige,SHIZhili.EffectsofnutrientsonthegrowthandthecompositionofnitrogenandphosphorusofSkeletonemacostatumandMitzschiaclosterium[J].OCEANOLOGIAETLIMNOLOGIASINICA,2003,31(1):46-52.[7]ChristopherAK,ElenaLitchman,TanguyDaufresne1elt.Optimalnitrogen-to-phosphorusstoichiometryofphytoplankton[J].Nature,2004,429:171-174.[8]沈颂东.氮素对小球藻生长的影响[J].水利渔业,2003,23(2):55-57.SHENSongdong.effectsofnitrogenonthegrowthsofChlorellavulgaris[J].ReservoirFisheries,2003,23(2):55-57.[9]StéphaneL’Helguena，ChristianMadec,PierreLeCorre.NitrogenUptakeinPermanentlyWell-mixedTemperateCoastalWaters[J].Estuarine,CoastalandShelfScience,1996,42:803-818. 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