实验室常用液体配制标准操作规程.doc

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1、国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心常用液体配制SOP常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订23国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心常用液体配制SOP目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）23国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心常用液体配制SOP一、细菌培养系统1、L

2、B培养基:每1000mL加分析纯NaCl10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，用ddH2O配制，再用10MNaOH调pH至7.4(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至1.5％，高压蒸汽灭菌15min后使用。3、10%(g/V)氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用0.22

3、滤膜过滤除菌后再分装。4、2.5%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含0.5g卡那霉素。取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（23国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心常用液体配制SOP卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单

4、克隆至试管中，于37℃，220rpm培养。剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competentcell）。将细菌置于0℃，低渗CaCl2溶液中时，菌细胞壁和膜的通透性增强，菌体膨胀成球型。外源DNA与Ca2+形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，在经42℃短暂的热冲击处理（一般热休克90s）后能促进细胞吸收外源DNA复合物。2）仪器、材料与试剂：①超净工作台、低温离心机、摇床、-80℃冰箱，装液氮的泡沫盒及液氮、50m

5、l的离心管2个，50ml的注射器及0.22um小过滤器各1个。高压灭菌的纸张、透气膜、1.5ml的EP管约350-500个，两块10cm的平皿板及接种环。②TB缓冲液：每200ml液体中含Mncl2.4H20(2.176g)、Cacl2.2H2O(0.44g)、Kcl(3.73g)、PIPES(0.67g)。（注：在电子天平上的误差<50mg,因Mncl2.4H20在PH=6.7易溶故先将其它药品用超纯水溶解,并用KOH及HCL调PH至6.7。在加入Mncl2.4H20溶解后用超纯水定溶至相应的量，采用50ml的注射器及小过滤器过滤,一般储存

6、在-20℃,时间<25天,否则易被氧化颜色呈粉红。）③LB液体培养基：参见前面介绍。23国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心常用液体配制SOP④LB固体培养基：参见前面介绍。⑤1管DH5α的菌种3）步骤：①倒无抗性的固体培养板，用接种环沾取感受态甘油菌画线,置于37℃恒温培养箱中培养过夜。②在超净台里采用小枪尖挑取培养板中的单克隆菌(菌落的大小约2~3mm)转接于200~250ml的LB液体培养基中,盖上透气膜。③置于摇床上，18℃、200-250rpm速度摇约需3~5天，使OD600=0.4~0.7（对数生长期或对数生长前期）时开始制备

7、。④取出TB缓冲液及无菌的50ml离心管置于4℃冰浴中，预冷低温高速离心机（4℃、2500rpm、10min）。⑤在50ml的离心管中加入约35ml-45ml的菌液，在4℃中冰浴10min。⑥取出后放置于离心机上离心4℃、2500rpm、10min。⑦弃上清液，在灭过菌的吸水纸上扣干（可重复多次收集菌体），先用约5~15ml的TB缓冲液重悬，再加至35ml的量（在冰上操作）冰浴10min。⑧重复⑥+⑦的步骤一次。⑨在35ml的TB缓冲液重悬后缓慢加入终浓度为7%的DMSO，混匀后在冰上冰浴10min。⑩分装成100-150ul/管（1.5ml

8、的EP管）浸入液氮中速冻，分装约300多管后转移放置于-80℃冰箱保存。23国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心常用液体配制SOP4）转化效率的评估：①采用小量