实时荧光定量pcr技术-全面分析

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1、实时定量PCR技术目录实时定量PCR基本原理实时定量PCR的实验设计和数据处理实时定量PCR两种相对定量方法比较实时定量PCR实验实例分析实时定量PCR常见故障排查实时定量PCR的新应用实时定量PCR基本原理常规vs实时常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析常规vs实时优缺点比较定量PCR常规PCR灵敏度高高精确度安全省时只能进行半定量或定性分析不安全易污染费时费力定量PCR三个基本概念扩增曲线指数增长期平台期线性增长期背景期阈值与C(t)值阈值：是循环

2、开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04定量PCR的数学原理理想的PCR反应：Xn=X0×2n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:logXn=log(X0(1+Ex)n)整理方程式得:logX0=(-log(1+

3、Ex))×n+logXn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+logXc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量化学原理化学方法分类非特异性SYBRGre

4、enI法特异性TaqMan探针法SYBRGreenI法结合双链DNA分子小沟延伸结束，形成双链DNA，SYBRGreen结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度优点使用方便，无需复杂的设计成本较低缺点与非特异性产物结合，无模板特异性试验方法较难优化灵敏度低TaqMan探针法水解型报告基团，淬灭基团FRET（荧光谐振能量传递）识别特异性产物优点特异性高，可准确定量灵敏度高设计不同标记的探针，可进行多重检测缺点一个探针只适用于一个目标价格较高探针设计较繁琐两种化学的比较化学试剂工作原理有否淬灭剂信号检测阶段SYBRGreenI结合于双链DNA的小沟中否延伸TaqMan

5、水解型杂交探针（5‘-3’外切）有任何步骤定量PCR的实验设计和数据处理绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）相对定量：计算初始反应模板的相对含量定量PCR--绝对定量标准品，标准曲线已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线样品与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值unknown104103使用定量PCR进行绝对定量的优势敏感性高检测低拷贝数样品：单拷贝大范围拷贝数样品同时检测100—1010省时有效定量PCR--相对定量相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍

6、数关系）相对定量的问题样品材料不均一造成的差别内标基因内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差SYBRGreenI法进行相对定量的问题问题：SYBRGreenI可以与非特异性双链结合非特异产物信号结果不准确解决办法：引入熔链曲线分析熔链曲线分析在PCR反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线温度荧光信号强度TmTm值：DNA解链一半时的温度-dIdTTm熔链曲线分析决定退火温度Non-specificproductspecificprod

7、uctspecificproduct实时定量PCR两种相对定量方法比较相对双标准曲线法和2-ΔΔc(t)法相对标准曲线法用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值用内标基因对目标基因均一化处理样本与未处理样本目标基因C(t)值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异适用范围目标基因与内标基因扩增效率差异较大扩增效率较低2-ΔΔc(t)法公式推导M:目标