ABI7500 PCR 用户基本操作培训幻灯.pdf

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1、ABIPrism®7500型荧光定量PCR仪用户基本操作培训美国应用生物系统中国公司客户服务部1内容提要1、仪器简况2、定量PCR的数学原理3、定量PCR的化学原理4、等位基因鉴定原理5、定量PCR实验6、定量PCR的数据处理7、日常维护8、应用举例2仪器简况7500功能一览•绝对定量(AbsoluteQuantification)–自动计算基线、阈值、C值、浓度、百分比T•相对定量(RelativeQuantification)•等位基因分型(AllelicDiscrimination)•阴阳性鉴定(Plus/MinuswithIPC)47500推荐使

2、用的荧光组合报告荧光(FilterA)FAM™或SYBR®GreenI报告荧光(FilterB)VIC™或JOE™报告或淬灭荧光(FilterC)NED™或CY3™或TAMRA™参比荧光(FilterD)ROX™或TexasRed®报告荧光(FilterE)CY5™5定量PCR的数学原理PCR曲线有两种表达形式线性图谱半对数图谱7典型的PCR分4个阶段平台期线性增长期指数增长期基线期8起点定量与终点定量ò起始DNA量是样本中本来的量，更有意义；终点DNA量经过PCR“加工”，不是研究所需要的数据ò起点定量误差小，终点定量误差大终点定量同一个样品重复96次

3、起点定量9什么是C值T定义：从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数C值必须位于指数增长阶段内T线性图谱半对数图谱C值C值TT10C值与起始DNA浓度的关系TC值TC=-klgX+bT0lg起始DNA浓度基线é阈值éC值T基线调整规则如果C值>18，不需调整，使用自动分析结果T如果C值<18，修改终点，再分析一次T起点：进口试剂取3，国产试剂取6终点：最小的C值–4，通常为15T长度：大于或等于6个循环阈值基线12C值T定量PCR的化学原理两种定量化学•染料法–SYBRGreenI•探针法–TaqMan探针–TaqManMGB探针14TaqMan探针定量原

4、理forwardprimerRprobeQ5'3'3'5'5'3'R5'Qreverseprimer5'3'1.聚合3'5'5'3'5'2.链取代RQ5'3'3'5'RQ5'3'5'5'3.探针被切断3'5'5'3'3'5'R=报告基团ReporterQ=淬灭基团Quencher4.聚合完成15TaqManMGB探针的好处MGB探针能够分辨1个碱基的差别完全配对，有信号FAMMGB一个碱基不配对，没有信号FAMMGB16TaqManMGB探针原理(non-fluorescentquencher)NFQQRQAGGCCTTGAGAGATATMGB(mino

5、rgroovebinder)R提高探针Tm值QAGGCCTTGAGAGATAT

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21、GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACR报告荧光NFQ无荧光淬灭基团MGB小沟结合物17SYBRGreenI染料法SYBRGreenI与DNA双链的小沟结合与DNA结合时发光游离时不发光18染料法的优点和缺点成本低不需要探针适合初步筛查先用SYBR筛查，再用TaqMan精确定量部分关键样品融解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体无模板特异性不能分辨主带与杂带，给出的是总信号不能做多重检测每孔只能检测一个目标基因灵敏度低

22、适合于5000拷贝以上的基因定量19融解曲线(Dissociationcurve)只有染料法才需要做融解曲线探针法没有必要[原始数据][导数图谱]20多重荧光定量原理使用多条探针，标记多种颜色，定量多个基因基因1基因221等位基因鉴定原理两种探针加入同一管野生型(wt)突变型(mut)23等位基因鉴定实验数据纯合子FAM杂合子实时结果纯合子VIC空白对照24等位基因鉴定实验分两步混合试剂PCR试剂+引物探针+2ng样品实时循环终点读板ABIPRISM®7500SDS分析数据25定量PCR实验96-孔板安排举例阳性对照标准品阴性对照未知样品27PCR反应程

23、序只要引物和探针质量符合要求循环参数就不需要修改Taq热启动实时定量UNG灭活UNG作用预防污染28数据分析方法1.实验结束，软件根据默认值的基线(3-15)自动分析，给出结果和图谱2.如果C值>18，使用自动分析结果，出报告T3.如果有C值<18，根据[最小的C值-4]TT修改基线终点，重新分析数据29怎样获得引物探针？1.推荐到www.appliedbiosystems.com上查询现成的试剂盒，保质期5年定量试剂盒：50万个，针对人类、大鼠、小鼠、Arabidopsis和果蝇的全部基因SNP试剂盒：40万个人类SNP位点2.或者提供60-300bp

24、的序列，AB为用户设计合成引物和探针30定量PCR反应体系试剂体积终浓度DNA5