piggyBac转座子在金鱼及泥鳅转基因中的应用-论文.pdf

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1、第36卷第1O期水产学报Vo1．36．NO．102012年lO月JOURNALOFFISHERIESOFCHINAoCt．．2012文章编号：1000—0615(2012)10—1473—09DOI：10．3724／SP．J．1231．2012．27930piggyBac转座子在金鱼及泥鳅转基因中的应用胡莹莹，郭学双，周阳，曹广力，贡成良，薛仁宇(苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123)摘要：为了探讨piggyBac转座子在鲤科鱼类及鳅科鱼类转基因中的适用性，实验通过将PAl3启动子控制的DsRed

2、表达元件插入pigA3GFP中，构建转基因载体pigA3GFP—AI3DsRed。用该载体对草鱼肾脏(CIK)细胞转染，结果显示，通过piggyBac转座子可将外源基因导入到CIK细胞的基因组中，来源于家蚕的A3启动子和来源于巨细胞病毒的CMV启动子在CIK细胞均具有活性。将转基因载体pigA3GFP、pigA3GFP—ApDsRed分别与辅助质粒helper．pigA3混合后以精子介导法导入金鱼和泥鳅的受精卵后，经荧光观察、PCR鉴定、Dotblotting鉴定，证实获得了转基因金鱼和转基因泥鳅。研究表明，PB

3、转座子在鲤科鱼类及鳅科的一些鱼中具有转座活性。关键词：金鱼；泥鳅；piggyBac转座子；转基因；草鱼肾脏(CIK)中图分类号：Q782；S917．4文献标志码：A鱼类因其产卵量大、绝大多数为体外受精、胚CMV启动子在CIK细胞中均有活性；并且通过胎透明、体外发育等特性已成为转基因动物的最精子介导的方法将PB转座子载体导入金鱼佳选择，并为研究胚胎发育过程提供了一个理想(Carassiusauratus)和泥鳅(Misgurnus模式⋯。转基因鱼的获得最初是通过传统的显彻g“删c口“口m)的受精卵中，通过荧光观察结

4、合微注射法，虽操作简单，但外源基因的插入和PCR和DNA斑点杂交鉴定，证明PB转座子在金表达效率低，并经常形成嵌合体或瞬时表达。鱼和泥鳅中具有转基因作用，研究结果为鱼类的转座子的发现为转基因鱼的获得提供了新的手段转基因研究工作开辟了新的途径。和方式。来源于鳞翅目昆虫粉蚊夜蛾的piggyBac1材料与方法(PB)转座子是一种宿主域极其广泛的转座子，已在多种动物上用于基因转移。而且，在进行1．1实验材料哺乳动物转基因研究中所表现出的整合效率高、大肠杆菌TG1菌株，pSK—sericinpromoter—负载容量大、稳

5、定的整合和传代、外源基因可长期DsRed质粒、转座载体pigA3GFP，以及A3启稳定表达、外源基因以单拷贝形式整合、易于确定动子驱动转座酶的辅助质粒helper—pigA3、CMV整合位点等优点引起了科学家们的广泛关注。启动子驱动转座酶的辅助质粒helper—pigCMV，均尽管PB转座子在斑马鱼(Danioreio)上具有由苏州大学医学部分子生物学实验室保存。草鱼活性，但在其他鱼类中的转座活性还没有正式报肾脏细胞购自中国微生物典藏中心(CCTCC)，金道。同时将外源基因导入到斑马鱼受精卵中的主鱼由苏州市相城区

6、某金鱼养殖场馈赠，泥鳅购于要方式是通过显微注射。本研究通过草鱼肾脏苏州市斜塘镇莲花市场。(Ctenpharyngodenidelluskidney，CIK)细胞探索TaqDNA聚合酶、TDNALigase，以及限制性PB转座子在CIK细胞中的转座活性，证实来源内切酶EcoRI、SalI、KpnI、BamHI及配套的缓冲液于家蚕的A3启动子和来源于巨细胞病毒的均为Fermentas公司产品。pMD一19T购自TaKaRa收稿日期：2012-01-05修回日期：2012-06-27资助项目：国家重大基础研究项目(20

7、12CB114605)通讯作者：薛仁宇，E-mail：xuery@suda．edu．cnhttp：／／WWW．scxuebao．cn1O期胡莹莹，等：piggyBac转座子在金鱼及泥鳅转基因中的应用l479在用piggyBac转座子进行转基因鱼的实验[5]BaluB，ShoueDA，FraserMJ，eta1．High—eficiencytransformationofPlasmodiumfalciparum中，我们通过精子介导法将转基因载体与辅助质bythelepidopterantransposableele

8、mentpiggyBac粒一起导人鱼卵中，经正常孵化、发育后，对其进[J]．ProceedingsoftheNationalAcademyof行荧光观察，可观察到明显发荧光的个体。对荧SciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2005，102光鱼的DNA鉴定结果也验证了荧光鱼中确实存(45)：16391—16396．在外源基因。进一步对荧光鱼的