药敏试验方案.doc

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1、1抗菌药物筛选1.1菌液的制备将菌株接种于普通琼脂平板上，置于37°C恒温箱屮培养24h,分别挑取单个特征菌落接种于灭菌肉汤培养基屮，置37°C恒温箱屮过夜培养。取过夜培养的菌悬液100yL加入到900gL的肉汤培养基屮，依次进行稀释，然后选取适半的浓度涂板，每个浓度三个平行。选取平板上菌落数H在30〜300之间的进行计数，最后用肉汤或无菌生理盐水配成浓度为5个X107-8CFU/mL的菌液作初筛用。1.2琼脂扩散法(K・B)抑菌试验用无菌棉签将浓度为5个X107-8CFU/mL的标准菌液均匀涂布于普通营养琼脂培养基上，

2、反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。然后用直径为6mm的无菌圆形玻璃管打孑L,将供试药物浓度为100mg/ml的药液加入孔屮，加满为止，不得溢岀。再将培养皿置于37°C恒温箱屮培养24h,取出观察，用卡尺测量抑菌圈的直径。每次实验前用人肠杆菌ATCC25922进行质量控制，设置阴性对照和阳性对照，阳性药物的选择依据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)公布的标准。1.3药敏试验判断标准按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS),抑菌圈直径d小于等于6为・；d小于等J10为+；d小于等于16为

3、卄;d小于等于26为+++；d人于26为++++。一般认为++以丄具有抑菌活性。2抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定2.1菌悬液的制备将细菌菌液接种到麦康凯培养基上进行纯化培养，37°C震荡培养24ho分别挑取单个特征菌落接种于灭菌肉汤培养基小，置37°C恒温箱屮过夜培养。取过夜培养的菌悬液100pL加入到900此的肉汤培养基小，依次进行稀释，然后选取适半的浓度涂板，每个浓度三个平行。选取平板上菌落数FI在30〜300之间的进行计数，最后用肉汤稀释菌悬液至含菌落数105〜106CFU/mL后备用。

4、2.2MIC和MBC测定将ImL的2倍终浓度的药物放到第1管，采用二倍稀释法将药液从第1管到第10分别稀释。第11管为阴性对照组（只加菌悬液，不放药物），第12管为空片对照组（只加肉汤培养基），第13管为阳性对照组（加入高敬感性物药和菌悬液）。将调好的菌液ImL分别加入相应的试管内，这将使每一梯度的抗细菌药物和菌悬液（2倍终浓度）分别被1:1稀释到终浓度。细菌于37C孵育12小时后判定MIC和MBC值。每次实验前用人肠杆菌ATCC25922进行质量控制。2.3MIC和MBC判定标准首先在观察阳性对照管长菌呈浑浊状，而阴性

5、对照管不长菌、呈透明状的前提下，再观察其他试管的浑浊情况。在不搅动的情况下肉眼判断，溶液清晰透明视为细菌完全不生长，取完全不生长管的最低纱物浓度为MTCo观察药物MIC以JL未见细菌生长的各管培养物，分别取0.1mL移种至不含药物的营养琼脂平板上，轻轻推开药液，置于37°C恒温箱屮过夜培养，观察有无菌生长，平皿培养基屮，无菌落生长者作为该药物的最低杀菌浓度。