医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序.pdf

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1、医院人感染医院人感染H7N9H7N9禽流感病毒核酸检测禽流感病毒核酸检测标准操作程序标准操作程序陈瑜传染病诊治国家重点实验室浙江大学附一院检验中心2013.05.23目的确保人感染H7N9禽流感病毒核酸检测过程标准化、规范化，避免因不规范操作对检测结果造成的影响，保证结果的准确性和可重复性适用范围医疗机构临床基因扩增实验室按照《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔2013〕383号）和《关于做好医疗机构人感染H7N9禽流感检测试剂供给保障工作的通知》（卫发明电〔2

2、013〕29号）有关要求，开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作。样本种类尽量采集患者发病早期的呼吸道样本：上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液；下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等尽量在抗病毒药物使用前采集可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率患者有下呼吸道样本时，应优先采集样本种类已发现H7N9病毒在痰和下呼吸道灌洗液阳性率高，持续时间长鼻咽拭子病毒检测阳性率低，持续时间短痰液标本中病毒能持续到治疗后第6天，而咽拭子标本并不能检测到采集前

3、的准备采集物品包采集前的准备常用的采样液/病毒运输液(VTM）1.pH7.4～7.6的Hanks液2.MEM/DMEM液若标本需要病毒培养，需在采样液中加入抗菌素，可用青霉素（终浓度100U/ml）、庆大霉素（终浓度1mg/ml）和抗真菌药物（两性霉素B，终浓度2µg/ml）。在无菌的带螺旋塑料管分装2-3ml采样液。最好储存在:–20℃；4℃可放48–96h，室温1–2天。采样拭子：使用头部为聚酯纤维的病毒采样拭子（鼻咽型），铝或塑料做柄，不推荐棉拭子和木柄样本采集1.咽拭子用2根聚丙烯纤维

4、头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖，贴上标签。√×样本采集2.鼻拭子将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖，贴上标签。住院病人标本采集实例门诊病人标本采集实例样本包装和运输人感染H7N9禽流感病毒实验室活动、样本采集和运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理样本

5、包装和运输样本采用密封容器包装，立即送往实验室，运输时在包装箱内填充吸水材料，运输过程中保持样本采集管直立状态，不能倾斜。若气温高时，需放入冰块降温。样本抵达实验室后，应尽快进行检测，24小时内能检测的样本可置于2～8℃暂时保存，24小时内无法检测的样本则应置于≤-70℃状态保存。如无-70℃保存条件时，可于-20℃冰箱暂存。样本避免反复冻融。样本包装和运输专用标本运送箱PCR检测原理根据荧光PCR技术原理，针对H7N9禽流感病毒的M基因、H7基因和N9基因保守区设计特异性引物和Taqman探针，

6、通过荧光PCR检测仪进行检测，从而实现对H7N9亚型禽流感病毒RNA的定性检测。荧光基团荧光检测元件M‐forward(GAGTGGCTAAAGACAAGACCAATC),M‐reverse(TTGGACAAAGCGTCTACGC),M‐probe:(FAM‐TCACCGTGCCCAGTGAGCGAG‐BHQ1);H7‐forward(AGAGTCATTRCARAATAGAATACAGAT),H7‐reverse(CACYGCATGTTTCCATTCTT)H7‐probe:(FAM‐AAACATGATGC

7、CCCGAAGCTAAAC‐BHQ1);N9‐forward(GTTCTATGCTCTCAGCCAAGG),N9‐reverse(CTTGACCACCCAATGCATTC)N9‐probe:(HEX‐TAAGCTRGCCACTATCATCACCRCC‐BHQ1).引物和探针PCR检测--样本处理核酸提取应当在样本处理区进行鼻/咽拭子标本应在保存液中充分搅动（至少40下），以洗脱拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后在4℃，10000rpm离心20分钟，上清液用于提取RNA。PCR检测--样本处理取

8、适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。病毒RNA提取可采用Trizol法、硅胶膜吸附法、磁珠法等，按相应说明书要求进行操作。提取好的RNA应及时用于检测，否则应当-70℃保存。如无-70℃保存条件，可于-20℃冰箱暂存。PCR检测--试剂准备、反应体系分管试剂准备应当在试剂准备区进行。根据所用的试剂盒，样本可进行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亚型或H7N9病毒核酸的检测。试剂的配制按所用试剂盒说明书进行。PCR检测-