实验4+紫外吸收法测定蛋白质含量.ppt

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1、实验七紫外吸收法测定蛋白质含量一、实验目的：学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用方法。二、实验原理：由于蛋白质中存在着酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸残基，它们的结构中具有共轭双键，对紫外光有吸收作用，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值OD280nm与其浓度（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比关系，280nm的吸光度故可作为蛋白质定量测定的依据。本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，低浓度的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的生化制备及其它研究中应用广泛，多用于纯化之蛋白质的微量测定，尤其是适合于柱层

2、析分离中蛋白质洗脱情况的检测。核酸在280nm波长下也有一定吸收能力，可能发生干扰。混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量，再按公式推算蛋白质含量。三、实验材料、主要仪器和试剂1．试验材料：待测的蛋白质溶液。2．主要仪器：（1）紫外分光光度计（2）试管与试管架（3）移液管3．试剂：浓度为1mg/mL标准酪蛋白溶液四、操作步骤1．标准曲线制作按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定各管溶液的光密度值OD2

3、80nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。2．样品测定：取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水9mL，混匀，按上述方法测定280nm的光密度，并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液的浓度。分光光度计的使用分光光度计的分类分光光度计的分类红外分光光度计:可见光分光光度计:紫外分光光度计:测定波长范围为大于760nm的红外光区测定波长范围为400~760nm的可见光区测定波长范围为200～400nm的紫外光区分光光度计的基本结构无论哪一类分光光度计都包括：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示:5个基本部件紫外分光光度

4、计1．光源：钨灯或卤钨灯——可见光源400～760nm氢灯或氘灯——紫外光源200～400nm2．单色器：把混合光波分解为单—波长光的装置3．吸收池（比色皿）：玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区4．检测器：将光信号转变为电信号的装置5．记录装置：讯号处理和显示系统紫外可见分光光度计使用方法（1）（1）测试准备①仪器预热30min后方可进行测试。②　将盛有“空白”或“对照”溶液的比色皿处于试样室光路位置；③　选择波长④　确定光源（2）测试过程①　数字显示透光度“100.0”(或吸光度“0.00”)2～3s后，将盛有

5、标准溶液的比色皿移至光路②　将盛有样品溶液的比色皿移至光路，记录该样品的数据。待第一个样品数据记录完毕后，将第二个样品置于试样室光路………，若有多个样品，操作以此类推。分光光度计使用注意事项（1）预热是保证实验结果准确可靠的必要步骤，不可忽略。（2）在波长320nm以下的实验范围一定要选用石英比色皿，绝不可以玻璃比色皿替代。（3）比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要将比色皿清洗干净。先用自来水将用过的比色皿反复冲洗，然后用蒸馏水淋洗，倒立于滤纸片上，待干后再收回比色皿盒中。必要时，还要对比色皿进行更精细的处理，如用浓硝酸或铬酸洗液浸泡、冲洗。（4）比

6、色皿与分光光度计应配套使用，否则会引起较大的实验误差。(4)比色皿内盛液应为其容量的2/3～3/4，过少会影响实验结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。(5)拿放比色皿时，应持其“毛面”，杜绝接触光路通过的“光面”。如比色皿外表面有液体，应用滤纸吸干，以保证光路通过时不受影响。(6)若待测液浓度过大，应适当稀释，一般应使吸光度读数处于0.1～0.8范围内为宜。