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1、现代生物工程制药专题2浅谈基因工程药物酵母表达系统高效表达调控研究进展主要内容基因工程药物酵母表达系统毕赤酵母表达系统优点毕赤酵母表达载体毕赤酵母表达菌株影响目的基因高效表达的因素34浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展1基因工程药物基因工程药物研制过程5浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展基本原理通过先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后利用限制性内切酶，从外源基因中将控制该蛋白质合成过程的目的基因取出来，再通过DNA连接酶把目的基因与载体（质粒噬菌体病毒）DNA连接，接着转入微生物或细胞内进行克隆
2、，并使目的基因最终在宿主细胞内成功表达，获得所需的蛋白质。6基因工程药物治疗肿瘤基因工程药物治疗病毒感染基因工程药物治疗心脑血管疾病基因工程药物治疗其他疾病浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展最新进展7酿酒酵母表达系统甲醇酵母表达系统其他酵母表达系统浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展2酵母表达系统8指可利用甲醇做单一碳源的一类酵母。毕赤酵母（Pichiapastoris)汉森酵母（Hansenulaploymorpha）假丝酵母（Candiaboidinii）浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达
3、调控研究进展甲醇酵母（methylotrophicyeast）9具有强有力的乙醇氧化酶(AlocholOxidase,AOX1)基因启动子。对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰。营养要求低,生长快,培养基廉价,便于工业化生产。具有强烈的好氧生长偏爱性,可进行细胞高密度培养。遗传稳定,表达量高。所分泌的糖蛋白的免疫原性较低,而且表达产物不含有毒物质和致热原。表达的蛋白可分泌到胞外,十分有利于纯化。浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展2.1毕赤酵母系统优点10自我复制型的游离载体整合型载体浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调
4、控研究进展2.2毕赤酵母表达载体表达载体与宿主染色体重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。11浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展↓启动子、外源基因克隆位点、分泌信号、终止子、选择标记、报告基因、复制起点、信号肽序列等毕赤酵母模式表达载体表达载体12乙醇氧化酶(AlocholOxidase,AOX1）启动子被最早成功地应用，也是目前最常用的启动子，它的甲醇诱导性很强，使在它控制下的外源基因能得到较高的表达。浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展毕赤酵母的启动子13浅谈基因工程药物目的基因真
5、核生物表达系统高效表达调控研究进展毕赤酵母中有2个醇氧化酶基因:AOX1和AOX2。AOX1可受甲醇专一诱导而高水平表达;AOX2虽然在序列上与AOX1的同源性达97%及以上且表达的蛋白具有相似的生物学活性,但AOX1的表达水平却明显高于AOX2，即启动能力强AOX1﹥AOX2。14AOX1基因主要受诱导和抑制机制调控当以甲醇为唯一碳源时,AOX1基因的表达可被甲醇严格调控,使得外源基因可严格保持在表达(有甲醇)-不表达(无甲醇)的模式。当以甘油或葡萄糖为碳源时,AOX1的转录被抑制。当AOX1基因缺失时,AOX2表达水平很低,乙醇氧化酶活力极大丧失,细胞
6、利用甲醇能力极大降低。浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展15作为筛选标记的基因和在细菌中进行复制起始点和选择标记(如ColEI复制起始点和抗氨苄基因)浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展毕赤酵母选择标记选择标记抗性标记对应于营养缺陷型受体的野生型基因，如HIS4、ARG4、URA316外源蛋白的分泌需要信号肽引导表达蛋白沿一定途径分泌至细胞外，外源蛋白的天然信号肽基因可与外源蛋白基因共同装入表达载体。浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展分泌信号肽序列17浅谈基因工程药物目的基因真核生
7、物表达系统高效表达调控研究进展甲醇营养型酵母表达系统一般利用两种来源的信号肽序列：一是外源基因本身携带的信号肽序列；二是来源于酵母的信号肽序列，如α因子、PHO1信号肽序列。18许多基因特定的A+T富含区可作为多聚腺苷酸或转录终止信号,导致仅产生低水平或截短的mRNA.某些稀有密码子,尤其是稀有密码子富集区往往也是制约翻译速率的因素.浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展2.2.2毕赤酵母表达系统的优化目的基因特性的改造：对策某些情况下,可通过定点突变去除成熟前终止结构域和替换稀有密码子.基因中存在大量A+T富含区和稀有密码子密集区时
8、,进行全基因合成,使编码序列符合毕赤酵母偏爱性密码子用法和具有更高
