HPV21分型产品操作培训.ppt

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1、凯普技术支持中心2013.04凯普HPV产品操作培训技术原理：基因扩增导流杂交低密度基因芯片分型：15种高危型别：HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68.6种低危型别：HPV6,11,42,43,44,CP8304（81）.21分型宫颈脱落细胞用棉试子擦去宫颈口的分泌物，取宫颈环状上皮与柱状上皮转化处宫颈脱落细胞男性尿道标本用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，捻动拭子采集上皮细胞，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检（采集标本前2小时禁小便）。男女性疣体标本既可以直接切下疣体组织放进无菌玻璃管内，又可以用一次性注射器把疣

2、体刺破后再用棉拭子反复擦拭病灶处脱落细胞置入无菌玻璃管，密闭送检。适用样本及采集方法①细胞学检测采集的样本中，凯普可以使用TCT检测所剩余的保存液来检测，但需要根据所剩细胞的浓度适当增加取样量至1~2ml。②如果必须使用同类产品保存液保存的样本，亚能与港龙的保存系统我司可以提取使用，HC-II的保存系统要确保未进行处理过才可使用。样本采集前注意事项A不可在碘试验和醋酸试验之后采集样本。（可能会抑制PCR反应）B检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等等阴道内用药物。（（可能会抑制PCR反应）C检查前48小时不应有性生活。D月经期不可采集标本。（防止血液过多）E注

3、意避免交叉污染。先采集HPV检测样本，再采集TCT或LCT、病理组织样本样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰箱4℃存放，并在一周时间内检测。应避免反复冻融。一周后检测的标本应保存在-20℃。样本采集前注意事项取800μl临床样本，加入离心管中14000rpm离心3分钟，去上清加入400μl溶液Ⅰ，混匀100℃裂解15分钟加入400μl溶液Ⅱ，混匀，放置5分钟14000rpm离心5分钟，去上清14000rpm离心1分钟，再次去上清加入60μl溶液Ⅲ充分溶解，-20℃保存对于无明显肉眼可见组织刷取物时，可适当加大实验样本量，或多次收集样本。取样前振荡混匀。溶液Ⅰ用于

4、裂解细胞，释放DNA。金属浴应防止爆盖发生，可压重物，15分钟后，待金属浴温度降至80℃以下再取出离心管；水浴应用螺旋盖离心管，旋紧，同时应防止进水。裂解后应点动离心再加入溶液Ⅱ溶液Ⅱ用于溶解脂类、蛋白质等杂质，沉淀DNA。溶液Ⅱ放入冰箱预冷可提高DNA的沉降效率该步意在充分去除溶液Ⅱ，因溶液Ⅱ为有机溶剂，会影响Taq酶的活性，抑制PCR扩增，导致IC点浅或者不出的情况。溶液Ⅲ用于溶解DNA。点样上机前，应进行离心，14000rpm，1分钟。以沉淀细胞碎片等物质，防止扩增受到抑制。超净工作台离心机标本制备区旋涡混合器微量移液器金属加热器离心机样本制备所需仪器提取操作注意

5、事项提取操作注意事项临床样本中有效细胞量太少：取500ul临床样本离心后，管底基本上看不到或者看到很少沉淀的时候，把第一次离心后的上清小心去掉，再加入500ul临床样本进行第二次离心，收集两次沉淀细胞。临床样本中血液太多：有些临床样本中由于种种原因，含有太多的血液。处理方法为取500ul临床样本离心后，去除上清，然后加入蒸馏水洗涤两次，或样本离心后用枪吸去沉淀的血细胞临床样本中黏液太多：1，建议医生按正确的方法取样。2，再加入500ul的临床样本，震荡混匀后，用1ml枪头洗出部分溶液，离心后按照正常的操作程序进行。如果离心后沉淀比较少，可以重复一次。3，将刷子连带粘在其

6、上的粘液取出男性样本或女性疣体样本提取方法（棉拭子样本）提取操作注意事项采集管内加500ul生理盐水，充分振荡↓溶液倒入提取管中，14000rpm离5min↓收集细胞↓下同宫颈分泌物标本操作采集管内加500ul溶液Ⅰ，充分振荡↓转移出400ul溶液至提取管中100℃加热15分钟↓下同宫颈分泌物标本操作方法一方法二因方法二会因细胞太少而出现假阴性的情况，故建议用方法一操作石蜡包埋组织样本提取方法提取操作注意事项WAYONE（1）称取0.01-0.05克石蜡标本，放入到1.5ml的微量离心管中。（2）加入1ml的二甲苯，室温下孵育10分钟除蜡，倒掉二甲苯。

7、（3）加入1ml100%无水乙醇，孵育10分钟，倒掉无水乙醇。（4）加入1ml95%1乙醇，孵育10分钟，倒掉。（5）加入1ml75%乙醇，孵育10分钟，倒掉。（6）室温下让乙醇挥发完全。（7）组织重新悬浮在400µl溶液Ⅰ和1µl50mg/ml蛋白酶K，震荡混匀。（8）样品56°C孵育3小时。(9)沸水中煮沸15分钟。(10)冷却,然后加入400µl溶液Ⅱ,充分混匀，室温下放置2分钟。(11)14000rpm离心5分钟。(12)去干净上清(13)加入60µl溶液Ⅲ,充分溶解。取1µl作为PCR模板进行扩增或储存在-20℃。新鲜组织样