引进马铃薯种质资源的检验鉴定方法.doc

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准XX/Txxxxx—XXXX引进马铃薯种质资源的检验鉴定方法Varietydetectionandidentificationofintroducedpotatogermplasm（送审稿）-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布木标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。木标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业科学研究院、重庆出入境检验检疫局。木标准主要起草人：宋云，刘杰，孙涛，李明福，段艳风，金黎平。引进马

2、铃薯种质资源的检验鉴定方法1范围木标准规定了引进马铃蒋种质资源的检验鉴定方法。本标准适用于已进行品种审定的马铃蒋品种。木标准适用于引进马铃薯种质资源的检验鉴定及其监管工作，适用于马铃薯种质资源引种人员和一线检疫人员。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为木标准的条款。凡是注口期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于木标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版木。凡是不注II期的引用文件，其最新版木适用于木标准。规范性引用文件：GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试

3、验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T3071-2011生物物种资源杏验技术规程ASTME1342-1997用冷冻、冷冻干燥和低温养护法保存细菌、真菌、原生生物、病毒、遗传要素以及动物和植物组织的保存(StandardPracticeforPreservationbyFreezing,Freeze-Drying,andLowTemperatureMaintenanceofBacteria,Fungi,Protista,Viruses,GeneticElements,andAnimalandPlantTissues)3术语和定义下列术

4、语和定义适用于木文件。3.1引进introduction异地引入新作物、新品种或品系及遗传材料。3.2马铃暮种质资源potatogermplasm通过出口国官方认证、贴有授权标识、用于种植、繁殖生产的马铃薯品种，包括块茎或试管苗。4原理马伶薯(Solanumtuberosum)属于被了植物门(Magnoliophyta)茄科(Solanaceae)茄屈(Solanum)。马铃薯不同品种的植株、叶片、花和块茎具有不同的特征。SSR(simplesequencerepeat)是一种广泛应用的分了标记技术。SSR标记具有数量丰富、周期短、不受环境条件影

5、响、高度多态性等优点。SSR主要应用于DNA指纹图谱构建、物种进化与分类、种质资源保存与利用、遗传多样性分析。5仪器电了天平、水浴锅、高压灭菌器、高温干燥箱、离心机、电泳仪、PCR仪、电泳槽、凝胶成像系统。植物光照培养箱或温室、高通量研磨机、涡旋慮荡器、可调移液器（lOOOuI,,200uL,100uL,20uL,10uL,2.5卩1,）、可调移液器枪头、离心管。6试剂及溶液CTAB,氯仿,异戊醇,异丙醇,EDTA,琼脂糖,Goldview染料,DNAmarker（500bp）,6x载样缓冲液,过硫酸氨,Acr-Bis,TEMED，冰醋酸,硝酸银

6、,硫代硫酸钠，氢氧化钠,甲醛7鉴定方法7.1形态鉴定利用肉眼观察样品植株、叶片•、花和块茎的形态特征（见附录A）。7.2DNA指纹图谱鉴定方法7.2.1马铃薯基因组DNA提取取0.lg植物组织（块茎或叶片），从屮提取DNA（见附录B）,并将DNA置于-20°C备用，提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将凝胶置于凝胶成像系统分析。7.2.2PCR扩增反应7.2.2.1引物及模板DNASSR引物序列信息来源于公开发表的文献，见附录C。PCR扩增的模板DNA包括待检测DNA、阳性对照为马铃薯基因组DNA和阴性对照以水代替模板DNA。7.2.

7、2.2扩增利用上述引物，将DNA样品进行扩增，阳性对照为马铃薯基因纽DNA和阴性对照以水代替模板DNA,按条件94°C预变性5min,94°C变性30s,53^64°C退火30s,72°C延伸45s,35个循环，72°C终延伸7min,完成PCR扩增（见附录B）,扩增产物置于-20€备用。7.2.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳将PCR扩增产物和500bpDNAmarker分别加入电泳凝胶样品孔，进行电泳，电泳结束后将凝胶置于凝胶成像系统分析（见附录B）。8结果判定根据附录A描述的植株形态、叶、花形态和块茎性状判定马铃薯的不同品种。通过成像观察，根据马铃

8、薯不同品种电泳条带（附录B）判定马铃薯品种。9样品保存与复核9.1样品保存品种资源的样品保存方法参照标准ASTME1342-1997。9