分子荧光和磷光分析法.ppt

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1、第三章分子发光分析法一、仪器与结构流程instrumentandgeneralprocess二、荧光分析法和应用fluorescenceanalysisandapplication三、磷光分析法的应用phosphorescenceanalysisandapplication第二节分子荧光与磷光分析法molecularluminescenceanalysismolecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis2021/10/8一、仪器结构流程测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源

2、、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。2021/10/8荧光(磷光)分光光度计:光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器2021/10/8仪器光路图2021/10/8仪器框图该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；2021/10/8紫外-可见分光光度计测量池(吸收池)荧光分光光度计样品池I0ItI0ItIF,p2021/10

3、/8同步扫描技术根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种；同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；如图。合适的可减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但<15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱；>60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。2021/10/8可获得三维光谱图的仪器可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图2021/10/82021/10/82.三维荧光光谱IF∝f(λe

4、x、λem)蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长2021/10/8IF∝f(λex、λem)蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长2021/10/8蒽的三维等高线光谱图2021/10/8蒽的三维等荧光强度光谱2021/10/8磷光检测荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶。2021/10/8二、荧光分析方法与应用1.特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光

5、度法高2～4个数量级；为什么？检测下限：0.1～0.1g/cm-3相对灵敏度：0.05mol/L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少缺点：应用范围小。2021/10/82.定量依据与方法(1)定量依据荧光强度If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：If=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)浓度很低时，将括号项近似处理后：(麦可劳林级数展开)If=2.3I0lc=Kc2021/10/8

6、（2）定量方法标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；（荧光增强法，荧光降低法）比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；导数法：时间分辨法：同步扫描法：矩阵法：2021/10/8测定条件的选择1.激发光和荧光波长的选择2.散射光的干扰及消除3.试剂的纯度及操作过程杂质的引入2021/10/83.荧光分析法的应用(1)无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、

7、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析见表2021/10/82021/10/82021/10/8三、磷光分析法的应用1.稠环芳烃分析采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表2.农药、生物碱、植物生长激素的分析烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析检测限0.01g/cm-33.药物分析和临床分析见表2021/10/82021/10/82021/10/8内容选

8、择第一节分子荧光和磷光molecularfluorescenceandphosphorescence第二节分子荧光和磷光分析法molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis结束2021/10/8麦克劳林级数展开20