第五章 连、转、筛.ppt

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1、第5章连、转、筛一、DNA片段的重组连接目的基因和载体DNA是重组的基本构件。DNA片断的重组连接是目的基因与载体的连接。获得目的基因后必须将其放在一定的载体上才能进入宿主细胞扩增或表达。载体（bus）将目的基因（乘客）送到宿主细胞（理想的天堂）去繁衍生息，春花秋实，建功立业。习惯上将目的基因与载体连接及其后续的转化过程称为克隆，可能是目的基因＋载体形成一个新的DNA重组分子（新的genotype），后者必然会产生一个新的菌体克隆（phenotype）。限制酶剪切或机械剪切目的基因或载体可以产生粘端和平端的DNA分子。催化二

2、者重组连接（粘端或平端）反应的酶常用T4DNAligase。（一）粘性末端连接1.利用相同的酶切位点——单酶单切点用同一种酶分别切割目的基因/载体，然后进行连接。优点：二者产生相同的粘性末端，彼此很易按碱基配对退火，在ligase作用下生成DNA分子重组体。geneEcoRⅠvectorEcoRⅠ问题与解决办法：（1）自身环化粘性末端自发形成双链，连接产物含大量的目的基因和载体自身环化的假重组体－>若转化则出现假阳性克隆。解决办法是用高浓度的DNA（目的基因：载体为3：1）和碱性磷酸酶（AP：BIP/CIP）处理载体，去除5

3、‘－P使之不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复。（2）不能定向克隆/插入由于是单一位点，目的基因可以以不同方向插入载体。对于克隆扩增问题不大，因为克隆上去的基因再重组时又要切下来；对于表达载体目的基因必须按5‘－3’方向克隆在启动子下游而不能反之。此时只能靠运气了。2.利用不同的酶切位点——双酶双切点（定向克隆）优点（1）避免载体/目的基因的自身环化，提高连接效率；（2）可控制外源基因插入方向。构建表达载体时最好使用双酶双切点，这样方式也称定向克隆。如：目的基因和载体都有EcoRⅠ，PstⅠ酶切位点，产生各自互补粘端，分别配

4、对连接。E.coRⅠgenePstⅠEcoRⅠvectorPstⅠ3.利用同裂酶，分别切割目的基因/载体，产生相同粘端，因而可以连在一起，如：5’——GGATCC——3’Saw3AIgeneBamHIvector3’——CCTAGG——5’构建表达载体时，同裂酶也很有用。ligase(xbalI)EcoRIEcoRI(HindIII)PUC(xbalI)EcoRI(HindIII)EcoRIEcoRI+EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIDigestionwithEcoRIRecoveryofAPPAIDNAframag

5、aroseAPOAIPUCQ-APOAIPBR325-APOAIPUC9PUC9APOAIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIFigure8-3strategyofconstructionofrecombinantpucq-APOAIplasmiaE.coli*4.（1）3’端突出只能切平是因为DNApol合成需要引物（加在3’－OH末端）且只能按5’－3’方向。（2）切平填平图示：5’合成填平5’3’切平3’5’核酸酶切平3’5’5’—突出末端3’—突出末端（3）切平除用于重组连接外，还可用于阅读框修改，如：EcoRⅠ

6、5’—GATCGAATTC—3’5’GATCG-----1.目的基因、载体平端平端直接连接没有合适的产生粘端的限制酶切位点，可采用平端连接，但连接效率<粘端。并且连接反应中更偏向于载体自身环化，拟用下述措施可提高连接效率。措施：（1）大大增加ligase量，有人估算是粘端同等条件的100倍。（2）增加目的基因DNA分子量，增加与载体碰撞的机会。（3）BIP或CIP去除载体两端5’—P基团，防止环化。（二）平头末端的连接平端的4个来源载体目的基因连接或克隆策略①少数限制酶如HaeⅡ对称切产生平端√√cDNA①目的基因载体平端平

7、端连接②机械剪切如皮试小头针挤压DNA产生平端√√cDNA②加人工接头连接（cDNA/vector）③逆转录生成cDNA是平端√cDNA③用衔接接头取代人工接头连接（cDNA/vector）④5’端突出，用酶切平，或用酶填平3’端；3’端突出只能切平，不能填平产生平端√√cDNAcDNA④通过同聚尾连接(cDNA/vector)⑤T载体，PCR产物T/A克隆法⑥PCR引入限制酶切位点平端目的基因DNAEcoRⅠ甲基化酶加linker（已磷酸化加了5’—P）PGG↓AATTCCGG↓AATTCCCCTTAAGGCCTTAAGG

8、PT4ligase平端连接形成交聚接头GGAATTCCGGAATTCCCCTTAAGGCCTTAAGGGGAATTCCGGAATTCC---CCTTAAGGCCTTAAGG---EcoRIAATTCCGGGGCCTTAA在目的基因末端连上人工接头与同样酶切（EcoRⅠ）的载体连接2.加人工