聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法.doc

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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法(一)管型盘状电泳1.仪器和设备图8管型盘状电泳槽结构A为正面B为剖面(1)  分离胶PH8.9(2)浓缩胶PH6.7(3)电极缓冲液PH8.3   电泳槽：盘状电泳槽国内有很多单位生产，也可因地制宜，自己制造，槽大多为圆筒形(图9)，也有长方形的，上、下槽分别接铂金丝电极，要注意电极到各胶管的距离相等，以保持各凝胶管的电场一致。电泳仪：国内生产的型号很多，如北京六一仪器厂的DYY-Ⅲ型，电压在0～600v内任意调节，电流输出0～100mA，这类电泳仪比较恰当。玻璃管：选择粗细均一的圆玻璃管，内径5～7mm左右，管长70～100mm

2、。管口用金刚砂磨平，电泳管的清洁很重要，需浸入10%重铬酸盐-硫酸溶液中清洗，再用蒸馏水彻底淋洗干净，在管中滴入丙酮而后干燥备用。聚胶架：普通试管架式样，有机玻璃制成，架的孔洞内装一乳胶管，要求乳胶管孔内径与玻璃管外径相同或略小。微量注射器或微量进样器：加样时，由于需样品量极小，作定量分析时要求样品量准确，因此最好用25.50或100μl的微量进样器加样，也可用50或100μl加液器代用。普通注射器：主要用于灌胶和剥胶，20～30ml，附加10号不锈钢长针头(约10cm长)。其他：日光台灯，PH计，恒温水浴，烧杯，容量瓶，量筒，试管，漏斗，滤纸，电炉，电子天平

3、等。2.试剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)；丙烯酰胺(Acr)；四甲基乙二胺(TEMED)；过硫酸铵；核黄素(VB2)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；蔗糖；甘氨酸；盐酸等。丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺产品不纯时需要纯化后才能使用。(1)丙烯酰胺纯化法：70g丙烯酰胺溶于500ml氯仿中(50℃)，热滤，滤液凉后置-20℃冰箱，即有结晶析出，砂芯漏斗过滤，收集结晶。结晶置于真空干燥器中减压干燥，贮棕色瓶中备用。(2)甲叉双丙烯酰胺纯化法：12g甲叉双丙烯酰胺溶于100ml40～50℃丙酮，加热过滤，滤液置-20℃冰箱，结晶析出后过滤，并置于真空干燥器中干燥，保存于棕色瓶中备

4、用。3.试剂配制(1)凝胶及缓冲液配制系统有关资料很多，可以根据需要选择适宜的系统。列表4供参考。最常用的是系统1(所谓Davis的标准状态)。各种贮存液配制后，盛于棕色瓶中，贮冰箱备用。用时需测PH值，以检查是否失效。TEMED要密封贮藏。过硫酸铵溶液最好现用现配，不宜超过一周。表4几种适用电泳的聚丙烯酰胺凝胶系统系统Ⅰ(PH值8.9)(7.2%)系统Ⅱ(PH值7.5)(7.5%)系统Ⅲ(PH值4.3)(15%)系统Ⅳ(PH值2.9)(7.5%)溶液号组份/100mlPH值溶液号组份/100mlPH值溶液号组份/100mlP

5、H值溶液号组份/100mlPH值11mol/lHCl48.0mlTris36.3克TEMED0.46ml8.9151mo;/LHCl48.0mlTris6.85克TEMED0.46ml7.5171mol/LKOH48.0ml醋酸17.2mlTEMED4.0ml4.3201mol/lKOH12.0ml醋酸.25mlTEMED1.15ml2.92a丙烯酰胺28.0克双丙烯酰胺0.735克82丙烯酰胺30.0克双丙烯酰胺0.8克68丙烯酰胺60.0克双丙烯酰胺0.4克 21过硫酸铵2.8克 3过硫酸铵0.14克 161NH3PO439.0mlTris4.95克TEM

6、ED0.46ml5.518过硫酸铵0.28克 221NKOH48.0升醋酸2.95ml5.94a1NHCl6.7   191NKOH6.7   48mlTris5.98克TEMED0.46ml48.0ml醋酸2.87mlTEMED0.46ml5丙烯酰胺10.0克双丙烯酰胺2.5克6.7         6核黄素4.0mg          7蔗糖40.0克          电极缓冲液：Tris6.0克甘氨酸28.8克加水至1升使用：10%稀释液8.3电极缓冲液：二乙基巴比妥5.82克Tris1.0克加水至1升7.0电极缓冲液：β-丙氨酸32.2克醋酸8.0克

7、加水至1升使用：10%稀释液4.5电极缓冲液：甘氨酸28.1克醋酸3.06ml加水至1升使用：10%稀释液4.0电极：上槽接负极Θ下槽接正极⊕电极：上槽接负极Θ下槽接正极⊕电极：上槽接正极⊕下槽接负极Θ电极：上槽接正极⊕下槽接负极Θ各溶液混合比各溶液混合比各溶液混合比各溶液混合比浓缩胶分离胶浓缩胶分离胶浓缩胶分离胶浓缩胶分离胶1份4a号2份5号1份6号4份7号1份1号2份2a号1份水4份3号1份16号2份5号1份6号4份7号1份15号2份2号1份水4份3号1份19号2份5号1份6号4份7号1份17号2份8号1份水4份18号1份22号2份5号1份6号4份7号4份

8、20号2份2号2份21号(2)指示剂配