核酸标记各种标记物及标记方法.doc

《核酸标记各种标记物及标记方法.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、1．核素标记物放射性核素是目前应用最多的一类探针标记物。放射性核素的灵敏度极高，可以检测到10-14～10-18克的物质，在最适条件下可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。常用标记核酸探针的核素有32P、3H、35S，在Southern印迹杂交中以“P最常用。还应根据标记方法的不同选择相应标记方位的核素，一般情况下，大多数标记方法需要的是a—32P，而5，末端标记必须是r-32P。　　　　2．非放射性标记物多年来，科学家们致力于寻找一些安全、可靠、灵敏度高的物质代替放射性核素用于核酸分子杂交，并

2、取得了一定的进展，部分非放射性标记物已在国内外逐步推广使用。其优点是无放射性污染，可以较长时间存放，从而更便于临床诊断等方面的应用。但此类非放射性标记物的缺点是灵敏度及特异性都不太高。根据其检测方法，非核素标记物可分为以下4类。　　(1)半抗原：生物素(biotin)和地高辛(DIG)都是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫学检测，根据显色反应检测杂交信号。这两种物质是目前使用较普遍的非核素标记物。　　(2)配体：生物素不仅是半抗原，故可用生物素与亲和素反应进行杂交信号的检测。　　(3)荧光素：如

3、FITC、罗丹明类等，可以发出紫荧光进行观察，主要适用于细胞原位杂交。　　(4)化学发光探针：一些标记物可与某种物质反应产生化学发光现象，通过化学发光可以像核素一样直接使X线胶片上的乳胶颗粒感光。化学发光探针可能是今后非核素标记物研究的主要方向。三、标记方法体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针

4、分子上酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上酶促标记法(一)切口平移法(nicktranslation)1、利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在切口处将旧链从5′末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3′末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中(二)随机引物法其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作

5、为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按5′→3′方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中。(三)PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中