DNA微阵列(或芯片)技术原理及应用.ppt

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1、DNA微阵列(或芯片)技术原理及应用DNA微阵列或芯片(DNAmicroarrayorchip)技术是近年发展起来的又一新的分子生物学研究工具.它是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相表面合成成千上万个寡核苷酸探针，或将液相合成的探针由微阵列器或机器人点样于尼龙膜或硅片上，再与放射性同位素或荧光物标记的DNA或cDNA杂交,用于分析DNA突变及多态性、DNA测序、监测同一组织细胞在不同状态下或同一状态下多种组织细胞基因表达水平的差异、发现新的致病基因或疾病相关基因等多个研究领域.摘要1概念理论DNA微阵列或芯片是指在大规模集成电路所控制的机器人在尼龙膜或硅片固

2、相支持物表面，有规律地合成成千上万个代表不同基因的寡核苷酸“探针”，或液相合成探针后由阵列器（arrayer）或机器人点样于固相支持物表面.这些“探针”可与用放射标记物如32P或荧光物如荧光素、丽丝胺等标记的目的材料中的DNA或cDNA互补核酸序列相结合，通过放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描后，对杂交结果进行计算机软件处理分析，获得杂交信号的强度及分布模式图，以此反映目的材料中有关基因表达强弱的表达谱.2DNA微阵列或芯片的制作和原理2.1固相表面高密度寡核苷酸探针的合成及排列采用光导化学合成和照相平板印刷技术可在硅片表面合成寡核苷酸探针，如图1.当光通过照相平板印刷的“面具”到达固相合

3、成特定区域时,则激活这些区域内的酶底物（如α-甲基-6-氮胡椒酮甲羰基）,而产生自由羟基和使受光保护的基团去除,继而脱氧核酸盐通过化学连接键添加于去保护位点上;当光通过另一个新的“面具”到达酶底物的另一个区域发生同样反应,如此循环直到所需要的核酸全部被合成.而每次所添加的脱氧核酸是由“面具”上的顺序所决定的,而后者又是由计算机根据设计者需要所控制的,因此一个限定长度的寡核苷酸则排列在预定位置上.对于N个碱基的探针，需4N个化学合成循环步骤可达到4n个探针数，如探针长度为4个碱基，化学合成循环步骤为16次,探针数为256个；如探针长度为8个碱基，则合成循环需32步即可达到65536个探针.

4、这些探针在不同的照相平板印刷分辨率作用下,可在单位面积上合成不同的位点数.如分辨率为200μm，合成密度为2500个位点/cm2，如分辨率为20μm，合成密度为250000个位点/cm2等，由此构成高密度寡核苷酸微阵列2.2液相探针的合成及在固相表面的排列由已知基因序列在液相中化学合成寡核苷酸链探针，或通过PCR技术扩增已知基因的编码区部分序列，或克隆的基因组片段，均需通过纯化产物后再定量分析.再由具有多个微细加样孔的阵列复制器（arrayingandreplicatingdevice,ARD）或阵列机（arrayer）及由电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷

5、的尼龙膜或预处理好的硅片相应位置上，再由紫外线胶联固定后即得到DNA微阵列或芯片2.3探针的杂交和检测DNA微阵列或芯片用于检测基因表达、多态性或突变等实际上是一种反向斑点杂交技术.代表不同待检测基因的“探针”被固定于微阵列或芯片上，而被检测核酸DNA或由mRNA逆转录而来的cDNA群体用放射性32P/33P或荧光物标记后与固相阵列杂交.如被检测核酸中有与阵列上“探针”互补的序列存在，则二者以氢键结合.在被检测核酸浓度、温度、缓冲液及盐浓度等相同条件下,结合在“探针”上的被检测核酸量与其碱基构成和靶-探针匹配的量所决定.对于一个相同长度的探针,GC含量较高2.3探针的杂交和检测的与靶结合

6、的强度高于AT含量较高者,靶-探针完全匹配者结合强度远高于二者间存在不匹配、插入或缺失.结合在“探针”上的被检测核酸可通过放射自显影或激光共焦显微镜检测杂交信号强弱和分布,再通过计算机软件处理分析,得到有关基因的表达谱.3应用3.1基因表达水平的检测DNA微阵列或芯片应用于基因表达水平检测的最大优越性是可自动、快速检测目的材料中成千上万个基因的表达情况.DNA微阵列或芯片技术已在某些植物、细菌、真菌的整个基因组范围内对各基因表达水平进行快速的检测.而在HGP完成之后，用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期定不会遥远。3.2寻找可能致病基因或疾病相关基因用cD

7、NA微阵列技术通过比较组织细胞基因的表达谱差异，可以发现新的可能致病基因或疾病相关基因3.3基因点突变及多态性检测根据已知基因的序列信息可设计出含有成千上万个不同寡核苷酸探针的DNA芯片，再用荧光标记待测DNA，如二者完全匹配则杂交后结合牢固荧光强度高，如不全匹配则荧光强度弱或无.由此可判断点突变的存在与否及部位和个数.根据这一原理如对N个碱基长度序列的每个碱基进行筛查，则需4×N个探针即可.3.4DNA序列测定虽然Sanger、M