探针的设计原则

《探针的设计原则》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、实时荧光Taqman探针设计的几个要点实验室很多同学都要做RealtimePCR实验，实验室的师兄师姐都会冇很多宝贵意见，不过也冇实验室前没冇做过的，查找了下资料和人家分享下关于实时荧光Taaman探针设计、实时荧光PCR探针的选择、引物的设计及评价。荧光探It法是用序列特异的荧光标记瘗t来检测产物，探牡法的岀现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaaMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分了信标MolecularBeacon。广泛使用的TaaMan探针法是指PCR扩増时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探牡，该探牡只与模板特

2、异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5端标记有荧光报告基团(Reporter,R),如FAM、VIC等，3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q),如TAMRA等。当探针完整的时候,5,端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3,端荧光基团淬灭，仪器检测不到5,端报告基团所激发的荧光信号(就是说5'荧光基团的发射波长正好是3’荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3'荧光棊团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的輕，其5F外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探铉不受影响)就会将切割探铉，释放5端报告基I才I游离于反应体系中，

3、远离3,端荧光淬灭基团的屏蔽，5,端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说毎扩増一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代衣了模板DNA的拷贝数。(请注意，该图显示的不是通的Taqman探针法，而是TaqmanMGB探针法)Taaman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团冇FAM，TET,VIC,HEX等等。当探针完整的时候,山于3端的荧光淬灭基团在吸收5,端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来乂有新的发展——TaqManMGB探针。MGB探针的淬灭基团釆川

4、非荧光淬火基团(Non-FluorescentQuencher),本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时變t上还连接有MGB(MinorGrooveBinder)修饰基团，可以将探铉的Tm值捉高109左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短,既降低了合成成本，也使得墾t设计的成功率大为提高一因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的變t比长的更容易设计。实验证明，TaqManMGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。Taqman探针法已经得到广泛使用,不过有人认为这种技术利用了Taq酶5-3'外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq

5、酶的聚介酶活性定标，没冇同时给Taq酶5-3'外切酶活性定标，不同批号试剂Z间会给定量带來差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60C这就使不同试剂盒Z间的特异性参差不齐，难于做质控检测。RealtimePCRTaqman卷针设讣、实时多重PCR探针的选择和引物的设汁及评价一、实时荧光Taqman探针设计总原则：探针选择要保导,引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保疗的片段来设计引物与探针。即real-timePCR的扩增片段是50bp—150bp。当找不到150bp的保守片段时,必须确保探针的片段是保守的。在设计探牡和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探

6、牡。但要注意的是：在那条链上设计探针时,就应靠近在同一条链上设计的引物（即上游引物）。这样，可保证在将來扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出來。两者的距离最好是探it的5'端离上游引物的3'冇一个碱基，但也可以重叠。若在原序列中找不到合适的探it与引物（1主要是探针和上游引物的距离太远，而离卜•游引物的距离却较近时;2突变位点要求在探牡的5'端也能检测到荧光信号，但却是在3'端），可在互补的序列中设计引物与探生另real-timePCR屮的探针和引物的Tm值，均要高丁平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。二、探针的设计探针设计的基本原则：1.保守：探针要绝对的保守,有时分型就单

7、独依靠探it來决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不岀来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探牡的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于軽的杂交。且鼓好为A或T,而不能为G或A,因为A、T为双键，而G、A为三键。2.探针长度:Taoman探针的长度最好在25-32bpZ间，且Tm值在68-72VZ间，绘好为70°C,确保探牡的Tm值要比引物的Tm值高出10