电镜目前的技术难点及未来发展趋势

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1、5冷冻电镜目前的技术难点及未来发展趋势与其他的结构生物学和生物物理学研究方法类似，冷冻电子显微学在硬件设备上的长足进展解决了很多关键性的技术难点，使该方法的应用普及成为趋势。同时，一些其他的技术难点凸显出来，成为结构解析中的瓶颈，需要更多的关注与投入。5.1样品制备技术样品制备一直是冷冻电子显微学研究的关键步骤。对于生物大分子结构研究来说，需要保证单颗粒分子以合适的密度均匀分布于厚度合适的无序冰中，才有可能获得良好的电子显微数据进行结构解析。由于不同的生物大分子与样品支持膜的相互作用及在水溶液中的性质各不相同，分

2、子在样品中的分布状态各异。目前普遍采用的冷冻制样技术在基本原理上仍然采用30年前发明的方法，实验可重复性、操作可移植性、通用性等都很差。样品制备已经成为冷冻电子显微学结构解析的限速步骤。冷冻电子显微学要想成为结构生物学研究的主要应用手段，必须在样品制备这一步骤取得重要的突破。类似的，对于细胞结构研究来说，将本身很厚的细胞样品进行减薄处理，才适合冷冻电镜观察。在过去的十多年里，冷冻切片技术一直在稳步发展，至今已经成为相对成熟的技术，但是对该技术的熟练掌握仍然需要长期的培训与实践经验。最近发展起来的聚焦离子束减薄技术

3、在未来可能会对冷冻细胞样品的结构研究带来新的契机。5.2高分辨率结构的分析与建模应用冷冻电子显微学技术在过去的两年里所获得的近原子分辨率（4Å以上）三维结构的数目几乎超过了前面几十年所获得的高分辨率结构数目之和。更多的在4~8Å分辨率范围内的结构在很短时间内被解析出来，不同的分辨率结构可以揭示出的结构细节亦不同。而与晶体学手段不同，冷冻电子显微学单颗粒重构无法通过对晶格衍射点的信号强弱来判断分辨率。因此，如何客观地对三维重构的结果进行检验、明确结构解析的分辨率是目前高分辨率冷冻电镜研究中的一个重要问题。在此基础上

4、，需要对不同分辨率水平的三维重构进行原子模型的构建，从而实现在原子水平上对分子功能的解释。对于分辨率在4Å以上的三维重构基本可以应用X射线晶体学现有的方法进行建模；对分辨率在4Å以下的三维结构如何建立较为可信的模型，则仍缺少相对成熟并被普遍接受的方法。一些研究组正在利用同源建模、分子动力学模拟等手段来进行这一分辨率水平的原子模型搭建的尝试。5.3生物大分子构象不均一性的分析冷冻电子显微学单颗粒结构解析技术与晶体学技术的一个重要差异是不需要溶液中的生物大分子形成高度有序的晶体排列，因而可以直接获得溶液中的生物大分子

5、结构。但生物大分子尤其是大分子复合体本身的构象柔性亦因此没有被固定在晶体结构中，这些构象柔性反映在电子显微图像中，常常是导致三维重构无法获得高分辨率结构的根源。将不同构象的分子分开分析，是提高重构分辨率的重要过程。此外，分子在溶液中的不同构象很可能反映了分子发挥功能的不同结构形态，理解这些构象差异对于解释分子功能的机制非常重要。目前对生物大分子构象不均一性的分析是冷冻电子显微学结构解析中的技术难点和热点。现有的一些算法通过聚类分析、最大似然法分析等对某些生物大分子复合物的结构解析取得了重要的发现，但对这个问题的解

6、决需要更多的新思路和新算法。5.4电子光学新技术方法在生物样品研究中的应用材料科学超高分辨率研究在过去十几年里也发生了很多重要的技术进步，主要是电子显微镜光学系统的不断完善和提高，以及新的成像手段的进步，新的技术诸如球差矫正、色差矫正、扫描透射电子显微镜系统等都在材料科学领域结构分辨率的显著提高中发挥了重要作用。目前，利用最新的电子光学成像系统，物理学和材料科学研究者已经可以获得0.5Å的分辨率。随着对生物样品近原子分辨率结构解析能力的逐渐普及，更高的分辨率必然成为冷冻电子显微学发展的下一个目标。如何应用材料科学

7、领域证明对超高分辨成像卓有成效的电子显微学方法来提高生物样品的结构解析分辨率，是摆在所有冷冻电子显微学家面前的新机遇和挑战。此外，新的技术如电子显微镜相位板（phase-plate）的开发与应用已经被证明对于利用单颗粒技术解析小分子量的蛋白质结构以及利用电子断层扫描三维重构技术研究细胞结构具有重大的促进作用。该项技术很可能在未来几年里引起冷冻电子显微学的另一次新的重大突破。5.5体内结构的研究自从上世纪中期建立以来，结构生物学主要是通过对分离纯化至体外的生物大分子结构进行解析。至今解析出来的多达10万的生物大分子

8、结构对于我们理解生物学过程的分子机制发挥了重要的作用。但迄今为止，我们仍无法通过直接观察获得细胞内乃至体内的生物大分子的原子分辨率结构。冷冻电子显微学尤其是三维断层扫描重构的发展给我们提供了这样的契机。通过更稳定的电子显微镜系统、更高效的数据采集装置、更强大的计算机处理工具，三维断层扫描重构将有可能帮助我们对细胞内的特定分子结构进行重构和统计分析，从而获得它们的高分辨率结