IL—32在病理性瘢痕中表达及其生物学作用探究

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1、IL—32在病理性瘢痕中表达及其生物学作田堀曲/■J［摘要］目的：探讨IL-32在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成过程中所起的生物学作用。方法：收集2009年10月至20"年6月广东医学院附属医院整形外科手术切除的瘢痕疙瘩组织12例，增生性瘢痕组织12例，正常皮肤24例，分别应用免疫组织化学技术、RT-PCR和WesternBlot检测IL・32在它们中的表达情况。结果：IL・32在正常皮肤增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中均有表达，在正常皮肤中表达较强，在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩组织中表达较弱；IL-32mRNA和IL-32蛋白在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达较正常皮肤明显降低(P均0.05'结论：I

2、L-32在病理性瘢痕组织的形成过程中起着一定的重要作用，有进一步研究的价值。［关键词］L32;增生性瘢痕；瘢痕疙瘩［中图分类号］R619+.6［文献标识码］A［文章编1008-6455(2012)11-1991-03病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩与增生性瘢痕，迄今尚无很好的治疗方法，是整形外科临床面临的棘手问题之一。1992年Dahl等⑴发现炎性细胞因子人白介素32(interleukin-32,IL-32),2005年KimSH等［2］提出其有很多炎症反应细胞因子的特性。近来研究证实其不但可诱导炎性细胞因子的产生，而且在调节细胞增殖与凋亡过程中有重要的作用［3］,已经成为肿瘤和结缔组织疾病

3、防治研究的重要对象［4］。病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩与增生性瘢痕，瘢痕疙瘩具有肿瘤样生长的生物学特性，且被认为是一种免疫性、炎症性疾病［5］oIL-32基因是否在病理性瘢痕的发生发展过程中起作用，据笔者所查文献目前国内外尚未见报道。本实验旨在通过检测IL-32在病理性瘢痕组织的表达来初步揭示IL-32在病理性瘢痕形成中所起的生物学作用，进而从另一角度认识病理性瘢痕的发病机制，可能从分子水平上为瘢痕防治提供新的思路。1材料和方法1.1材料:2009年10月至20"年6月收集广东医学院附属医院整形外科手术切除的瘢痕疙瘩组织标本12例，其中男性5例，女性7例，年龄17-42岁，平均年龄29.5

4、岁；增生性瘢痕组织标本12例，其中男性4例，女性8例，年龄9~41岁，平均年龄25岁；正常皮肤标本24例，其中男性17例，女性7例。年龄10-45岁，平均年龄29岁。标本取自先天性畸形、外伤、除皱术及包皮切除患者，取材部位为头面、胸腹及四肢，瘢痕病变时间3〜6个月。所有患者均无慢性疾病史，无长期服用药物病史，瘢痕未行局部药物注射治疗，并知情同意。1.2免疫组化检测标本中IL-32的表达：常规制备石蜡切片，干燥保存备用。按试剂盒说明书进行免疫组织化学（链霉菌抗生物素蛋白■过氧化物酹连结，SP）法，中性树胶封片。每一批标本均设已知阳性对照和用PBS替代一抗的空白对照，染色结果的判断以细胞

5、质和细胞膜出现棕黄色或者棕褐色颗粒为阳性染色。按盲法原则分别独立对实验结果进行评估。具体判断标准：采用专业图像分析软件IPP6.0对IL-32蛋白的表达进行定量分析。每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（x400）,测定每个视野下阳性反应的累积光密度和所有细胞总面积，以每例5个视野的平均光密度作为该例的测量值，平均光密度二阳性反应的累积光密度/细胞总面积。1.3RT-PCR检测IL-32mRNA表达1.3.1主要试剂：Trizol总RNA提取试剂盒、SuperScriptTMIIIFirst-StrandsynthesissystemforRT-PCR和普通琼脂糖（大连宝生物

6、工程公司）,PfuDNAPolymerase（Tiangen公司）,100bpDNAmarker（Santacruz公司），焦碳酸己二酯（DEPCX二甲基亚砸.（DMSO核糖核酸酶A（RNaseA漠化乙锭（EB）（Sigma公司1.3.2RT-PCR测定1.4WesternBlot检测IL-32蛋白的表达：提取组织总蛋白后，用BCA蛋白定量试剂盒测浓度。将标准品按0训、1pL2jjL4

7、jk8pk12pk16pL20pl加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20』，每一浓度做三个复孔。测定A562,计算各浓度蛋白标准的平均吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程。取上述蛋白样品各2

8、0pg,进行SDS-PAGE电泳和Westernblot检测。1.5统计学分析：实验数据统一采用SPSS15.0统计学软件分析，计量资料结果用均数士标准差（x±s）表示；两组间差异比较用t检验，三组间差异比较用方差分析和q检验。P>0.05差异无统计学意义，P0.05）（表1），表明IL-32蛋白的表达与瘢痕的增生有关。2.2RT-PCR检测结果：IL-32mRNA的扩增曲线、熔解曲线（图4）,增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组IL-32mRNA的相对表达量分别比正