(精选)微生物实验指导书11

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1、《微生物学实验实验指导书广东工业大学环境科学与工程学院实验一显微镜的使用、细菌革兰氏染色法及细菌特殊结构的观察（一）实验目的1.了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理2.学习并掌握汕镜的原理和使川方法。3.在油镜下观察细菌儿种基木形态1.掌握细菌革兰氏染色法（二）实验原理1.显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利川目镜和物镜两组透镜系统來放大成像，故乂常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两人部分组成。在显微镜的光学系统屮，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常呢置的儿种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微

2、生物学研究最为重要。为其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：1.增加照明亮度汕镜的放人倍数可达100X,放人倍数这样人的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最人。从承载标本的玻片透过來的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气,再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致便在便用油镜吋会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线冇所损失，在使川油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的汕镜（通常用香柏汕，其折射率n=1.52）o2.增加显微镜的分辨率显

3、微镜的分辨率或分辨力（resolutionorresolvingpower）是指显微镜能辨別两点Z间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的T涉现象及所用物镜性能的限制，分辨力D可表示为：D=A/2N.A,式中入=光波波长；NA=物镜的数值孔径值。光学显微镜的光源不可能超出可见光的波氏范围（0.4—0.7pm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA=nxsina式中a为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最人只能达到120O,而n为介质折射率。由于香柏汕的折射率（1.

4、52）比空气及水的折射率（分别为1・0和1.33）要高，因此以香柏汕作为镜头于玻片Z间介质的汕镜所能达到的数值孔径值（NA-般在1・2・1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA都低于1.0）o若以可见光的平均波长0.55pm來计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4pm的物体，而汕镜的分辨率却可达到0.2

5、jm左右。2.革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法所

6、以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是山这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结品紫结合成结品紫一•碘的复合物，从而增强了染料・细菌的结合力。当川脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞樂脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫■碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的监紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于英细胞壁肽聚糖

7、层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理吋，类脂质被乙醇（或内酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫■碘的复合物比较容易被洗脱出來，川复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。（二）实验器材1・菌种枯草芽砲杆菌12〜18h营养琼脂斜曲培养物、金黄色匍萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物2.溶液或试剂香柏汕，二甲苯，结晶紫染色液、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红染色液，蒸镉水3.仪器及相关用品显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蹑子（三）实验方法1•显微观察显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到汕镜的观察程序。汕镜观察高倍镜或低倍镜下找到要观

8、察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标木相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过1・0,还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏汕，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，总至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。2.革兰氏染色（1）涂片常规涂片法収一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸饰水,以无菌接种环分别挑取少虽菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁

9、净无油，否则菌液涂不开。（2）初染滴加结品紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）于两个玻片的