YB_10248_王连荣_ZY

《YB_10248_王连荣_ZY》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、论文中英文摘要作者姓名：王连荣论文题目：dnd基因簇对细菌DNA骨架的磷硫酰化硫修饰作者简介：王连荣，女，1980年03月出生，2003年09月师从于上海交通大学邓子新教授，于2008年3月获博士学位。中文摘要本研究致力于探索DNA硫修饰的发生方式，解析这种“前所未见”的生理修饰的精细化学结构，也为后续DNA硫修饰的生物途径、生物学意义等研究提供方向性指导。本学位论文成功地揭示了细菌中dnd基因簇可以将硫原子整合到DNA的磷酸骨架上,形成序列特异性、空间构象专一性的磷硫酰化修饰，揭示这种特异的生理修饰存在于不同的细菌中,并导致了电泳过程中的DNA降解表型。DNA降解表型(D

2、NAdegradation，Dnd)最初是从变铅青链霉菌中观察到的：电泳过程中，变铅青链霉菌的染色体不再是清晰的DNA条带，而是呈现降解状态。进一步研究发现，这是由于DNA上发生了一种异常的复制后修饰，导致DNA在电泳过程中容易遭受阳极产生的Tris过酸衍生物位点特异性攻击而产生双链切割反应。最近，研究者发现，这种异常修饰实际上是与dnd基因簇相关的DNA硫修饰。通过放射性35S喂养，在具有dnd同源基因簇/Dnd表型的变铅青链霉菌66，阿维链霉菌NRRL8165和荧光假单胞菌Pf0-1的DNA上检测到放射性硫信号，揭示出除了碳、氢、氧、氮和磷，DNA上还存在第六种元素——

3、硫。本研究首先通过35S半胱氨酸喂养具有dnd同源基因簇/Dnd表型的基因工程大肠杆菌，并分离到放射性硫标记的基因组DNA。随后，把基因组DNA酶解、去磷酸化成单脱氧核糖核苷，并利用高压液相色谱分离，结合液体闪烁计数器对每分钟分离组分的放射性强度进行检测，从而对硫修饰DNA分子的保留时间进行了精确定位，由此展开了对这种“前所未见”的硫修饰DNA化学结构的探索。基于硫修饰DNA分子在高压液相色谱中的“位置”，继而采用高压液相色谱-质谱联用技术对其组分进行分析，发现了一组可能来自硫修饰DNA分子特征性质谱信号597，446，348，152和136。其中，152是特征性的带有一个

4、正电荷的鸟嘌呤碱基(G)的核质比；136则是特征性的带有一个正电荷的腺嘌呤碱基(A)的核质比。提示我们在经过核酸酶的酶切后，可能的硫修饰分子仍然同时包含腺嘌呤和鸟嘌呤。结合这组核质比信号以及该分子对核酸酶具有抗性的特征，提出DNA分子的硫修饰可能发生在DNA骨架上，磷酸二酯键发生磷硫酰化成为硫代磷酸二酯键，并存在于脱氧鸟苷和脱氧腺苷之间，即5'-d(GPSA)-3'或者5'-d(APSG)-3'，暗示DNA硫修饰不像人们最初预料的那样发生在相对活跃的DNA碱基上。对基因工程大肠杆菌中硫修饰DNA分子和合成标准品进行了高压液相色谱-质谱联用、高精度质谱、紫外特征吸收色谱以及四

5、级质谱断裂模式对比分析，最终揭示出DNA硫修饰的化学本质，证实基因工程大肠杆菌中硫修饰DNA分子的确以硫代磷酸二酯键的方式、按5'-3'的方向序列特异性发生在脱氧鸟苷和脱氧腺苷之间——5'-d(GPSA)-3'。进一步利用对底物具有空间构象选择性的核酸酶对大肠杆菌中硫修饰DNA分子5'-d(GPSA)-3'进行水解；结合其在高压液相色谱中的保留时间提出DNA硫修饰不但具有序列选择性，还具有空间构象专一性，特异性地以RP构象存在。在Dnd表型的发现菌变铅青链霉菌中，利用放射性硫标记、高压液相色谱-质谱、紫外特征吸收色谱以及高精度质谱分析，发现DNA硫修饰在不同菌属中具有不同的

6、序列选择性。不同于大肠杆菌中的5'-d(GPSA)-3'RP，链霉菌的DNA硫修饰同样以硫代磷酸二酯键形式、RP空间构象存在，但序列特异性不同，发生在两个脱氧鸟苷之间——5'-d(GPSG)-3'。目前已经在100多种微生物中观察到Dnd表型，并在许多广泛分布的细菌中检测到dnd同源基因簇的存在。通过对来自截然不同栖息地的厌氧菌GeobacteruraniumreducensRf4、遍在远洋杆菌CandidatusPelagibacterubiqueHTCC1002、荧光假单胞菌PseudomonasfluorescensPf0-1、希瓦氏菌Shewanellapealea

7、naATCC700345、海洋细菌HahellachejuensisKCTC2396，以及海洋杆菌Oceanobactersp.RED65进行序列比对发现这些细菌的基因组中都具有dnd同源基因簇，包含5个或4个dnd同源基因。结合高压液相色谱-质谱联用分析，逐一鉴定出这些细菌都发生了DNA硫修饰，都以5'-d(GPSA)-3'RP或者5'-d(GPSG)-3'RP的方式在DNA骨架上发生磷硫酰化。说明DNA硫修饰不是偶然发生的生命现象，是广泛存在的具有序列选择性、空间构象专一性的新型修饰系统。体外化学合成的硫代磷酸