Western Blot 相关技术操作与原理

《Western Blot 相关技术操作与原理》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、WesternBlot相关技术操作与原理是什么？能做什么？为什么？怎么做？怎么办？印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－DNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。埃德温·迈

2、勒·萨瑟恩（EdwinMellorSouthern）是什么？DNA重组技术siRNA的转染技术表观遗传学（甲基化，miRNA）凡是涉及蛋白水平检测的研究，均可运用到westernblot技术能做什么？6.最后加上相应的底物溶液，当二抗上的酶催化底物产生化学发光时,用X光片曝光，洗片后就会产生可见的区带，指示目的蛋白质的位置和强弱。3.通过电泳将蛋白样品分开。5.印迹首先用封闭液（如5％的脱脂奶粉）处理以封闭固相载体上剩余的疏水结合位点，而后用目的蛋白的抗血清（一抗）孵育，印迹中只有目的蛋白质与一抗特异性结合。洗去游离的一抗后，用再与酶标记的二抗孵育4.将电

3、泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持体.转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进一步检测。1.提取细胞或组织蛋白，测定总蛋白浓度2.测定总蛋白浓度，并处理样品技术路线细胞总蛋白的提取总蛋白定量十二烷基磺酸钠―聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）转膜固相免疫检测为什么？怎么做？细胞总蛋白的提取提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理。提取蛋白质的方法很多，鉴于后续实验对蛋白性质的要求不同，因此很难找到一种万能的裂解方法。不论采用那种方法，都应遵循以下原则：1．尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。2．细胞和

4、组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解，蛋白酶抑制剂的种类很多，要根据具体情况具体选择。本实验中选用PMSF(苯甲基磺酰氟)作为蛋白酶抑制剂。3．样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80℃。切勿反复冻融已制备好的样品。B．RIPAbuffer：Tris-HCl50mM,pH7.4NP-401%去氧胆酸钠0.25%NaCl150mMEDTA1mM目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续实验的需求A．细胞总蛋白裂解缓冲液(100ml)：1×PBS80mlTritonx-1001ml去氧胆酸钠0.5gSDS0.1g补

5、1×PBS缓冲液至100ml.注意事项1.注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗。2.所用离心机需提前预冷。3.为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。4.吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。蛋白定量WesternBlot作为一项半定量实验技术，电泳前，必须尽量使各组之间总蛋白量基本一致;蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定;蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法的分辨力基于以上两方面原因，在进行蛋白电泳之前，先要对提取的总蛋白进行含量测定目前常用的有五种经

6、典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白

7、质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。本实验中用的Bradford法基于以下原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比此法的不足之处：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。Bradford法由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用：1

8、.灵敏度高：可精确定量1～1000µg/ml的蛋白样品。2.测定快