菌种的传代、保藏及菌液

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1、菌种的传代、保藏及菌液制备标准菌种的概念及其管理标准菌种是指由国家授权机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种。我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供菌种的名称铜绿假单胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］沙门菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）５００９４］枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８

2、００３］微生物菌种的使用、保存与管理、验证。一.制定菌种使用保藏管理程序（1）做好菌种的来源登记，确保溯源性清楚.（2）菌种的接收与复活标准菌种的保藏形式我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。培养基的选择细菌一般用营养琼脂培养基，特别指出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基进行传代。真菌一般用改良马丁培养基。菌种的传代菌种的复苏菌种的确认菌种的接种菌种的保藏菌种的复苏《中国药典》2005版规定，所用标准菌种的传代次数不得超过5代。

3、从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直至到第3代为工作菌种。严格控制菌种的传代避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作。1.复溶菌种并转种按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）2.鉴定菌种后制甘油冷冻管经菌种特性鉴定后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，保存管（为第二代）同时挑取纯菌落接斜面，工作用菌种（为第三代）3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于试验4.取1支（第二代）冷冻保存管转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管（第三代）斜面养基适当温度培

4、养后作为工作用菌种（第三代）5.将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。6.当工作用用菌种代数小于5时，可直接用上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三代）可直接转接第四代，直至四代转为五代。菌种保藏标签的规范与要求菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名称，系列号，传代次数，接种时间等。一旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必处理掉处理过程应记录。严格菌种的质量控制，确保菌种的质量菌种的质量对检验至关重要，对实验式储备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种进行纯度和

5、属性确认外，还应对每一次传代都进行确认的质量控制系统。因为微生物菌种从上一代传到下一代时，很可能发生污染或变异，因此每次传代中至少要对菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验。菌种处理的注意事项与有关记录菌种是特殊的标准品，在一定条件下，许多种类都是病原菌，这就要求处理菌种时有一些有别于其他标准品的特殊要求。1.根据菌株对人和动物的致病力、毒性流行传染的危害程度，要实行严密安全的保藏管理。2.所有的与菌种有关联的事情，例如菌种的接收、检查和保藏等都应有专门的微生物分析员处理和控制，建

6、立进出账目，填写菌种纪录，纪录内容包括：菌种名称、编号、来源、形态特征、培养特性、生化检定、传代次数、最适培养基和培养条件、保藏方法、储存条件及保存库址等。3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安全防护措施规程，采取有效预防措施进行自我保护。4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处，其他部门的人员未经允许不得进微生物实验室。所有的意外情况，都必须立即向主管部门报告以便得到及时解决。5相关记录在菌种的使用制备与保藏过程中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录格式。菌种的确认一.初步鉴定试验分离培养—菌落形态革兰染色—菌体染色特性及菌形生化试验—检测细菌对各种基质

7、的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌的种类二.全面鉴定血清分型毒素分析—内毒素和外毒素基因分型蛋白组分析自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）铜绿假单胞菌形态特征：G-杆菌、直或微弯、较细长、散在排列、无芽胞、有荚膜、单端有1～3根鞭毛。培养特性：专性需氧，最适温度为35℃，但在42℃生长是铜绿假单胞菌的一个特点。营养无特殊要求，普通培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成菌膜。分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基生化反应：氧化酶试验（＋）（培养物呈粉

8、红色渐变为紫红色）绿脓菌素试验（＋）（盐酸溶液呈粉红色）铜绿假单胞菌—琼脂平板的形态铜绿假单胞