现代生物技术2章

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1、第二章DNA重组技术---基因工程原理DNA重组技术也称基因克隆或者分子克隆，它实际上包括了一系列的实验技术，最终目的是把一个生物体中的遗传信息（DNA）转入另一个生物体。一个典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤（1）克隆重组：提取供体生物的目的基因(或称外源基因),酶解连接到另一DNA分子上(克隆载体),形成一个新的重组DNA分子；（2）转化：将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化；（3）筛选鉴定：对那些吸DNA的受体细胞进行筛选和鉴定；（4）培养表达对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检验外源基因是否表达。1、DNA结构与功能

2、2.1.1DNA分子组成：核苷酸（1）碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶（2）脱氧核糖（3）磷酸1.2DNA一级结构是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。DNA链上的脱氧核苷酸通过一个脱氧核苷酸的脱氧核糖3/-OH与相邻脱氧核苷酸5/-P形成磷酸二酯键聚合而串联成为DNA链。Cargaff等科学家在20世纪50年代总结出DNA碱基组成的规律：A=T，G=C，A+C=G+T，A+G=T+C。这一规律提示了A与T，G与C配对的可能性，为Watson和Crick提出了DNA双螺旋模型奠定了基础。1.3DNA二级结构Watson和Crick（19

3、53）DNA双螺旋模型：（1）DNA分子是上两条互相平行的脱氧核苷酸长链围绕同一中心轴相互缠绕而成；两条链均为右手螺旋。（2）DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替，彼此通过3/,5/-磷酸二酯键连接，排在外侧，构成基本骨架；4种碱基排列在内侧。（3）双螺旋平均直径2.0nm，两个相邻的碱基对之间的相距高度为0.34nm，两个核苷酸之间的夹角为360。因此，沿中心轴每螺旋一周有10个脱氧核苷酸，每旋转一周的高度（螺距）为3.4nm。（4）两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。A只与T配对，G与C配对。（5）碱基在一条链上的排列顺序不受到任何限制。但

4、是，当一条多核苷酸链的序列被确定之后，即可确定另一条互补链的序列1.4DNA链的大小（1）一个双链DNA分了的长度通常用互补核苷酸对的数目来表达，也就是人们通常所说的碱基对bp(basepair，bp)。（2）对于大的DNA分子通常用多少千个碱基对来表示，即kb(kilobasepairs，kb)。（3）当双链DNA分子超过几百万个碱基对时，人们就用百万碱基对,即Mb(megabasepairs，Mb)这个单位来描述它。1.5DNA分子的基本功能携带和传递遗传信息。（1）DNA复制（2）转录（3）翻译（1）复制：——半保留复制a、复制起点与复制单位、b、单向复制与双向

5、复制、c、滚筒式复制、d、D环复制（2）几个概念基因：DNA上具有遗传效应的碱基序列，是遗传信息传递、表达、性状分化的依据。结构基因：可以转录、翻译的基因。调节基因：控制结构基因表达的基因。重叠基因：同一段DNA可编码两种或两种以上不同蛋白的基因。跳跃基因：位置可移动的基因。假基因：结构与基因相似，但不表达。2、基因工程简介基因工程是按照人们的愿望对携带遗传信息的分子（DNA）进行设计和改造的分子工程，包括基因重组、克隆、表达；其核心是构建重组体DNA的技术，因而基因工程和DNA重组技术有时成为同义词2.1基因工程的理论与技术基础2.1.1理论基础1）证明遗传物质是D

6、NA：AVERY细菌转化实验2）DNA双螺旋结构阐明、半保留复制发现3)遗传信息传递方式、遗传密码破译、密码通用性发现2.1.2技术基础1）限制性内切酶与DNA连接酶纯化分离2）基因工程载体发明3）逆转录酶发现2.2基因工程常用工具酶（1）限制性内切酶（2）甲基化酶（3）连接酶（4）DNA聚合酶（5）反转录酶（6）依赖于DNA的RNA聚合酶（7）T4噬菌体多核苷酸激酶（8）碱性磷酸酶2.2.1限制性内切酶II特点（1）多数限制性内切酶II结合并切割DNA序列是一种回文结构；（2）切割后DNA产生5`--P突出末端，有些产生3`--OH突出末端；些酶切割后产生平末端。（

7、3识别序列可以是4、5、6、8，甚至更多的碱基对EcoRI是最早发现的一种类型II限制性内切酶，它是从大肠杆菌中分离鉴定出来的。EcoRI特异地结合在一段6个核苷酸的DNA区域里，在每一条链的鸟嘌呤和腺嘌呤之间切断DNA链(图2—4)。DNA链经EcoRI对称切割后会产生两个单链末端，每个末端会有4个核苷酸延伸出来，称为粘性末端。2.2.2限制性内切酶II主要用途（1）基因克隆（2）基因测序2.2.3类型II限制性内切酶的命名目前人们已经从各种不同的细菌中分离出了数百种其他的类型II限制性内切酶，这些酶的命名方式都一样，第一个字母采用含有此菌的细菌属