基因工程的基本操作程序的步骤

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1、用切目的基因相同的限制性内切酶切割质粒目的基因1.2基因工程的基本操作程序专题1基因工程目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序的步骤：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞阅读与思考1、什么是目的基因？2、获取目的基因的方法有哪些？其操作过程分别是怎样的？一、目的基因的获取1、目的基因概念：主要是指编码蛋白质的基因。(人类所需要的基因，如：抗虫基因、胰岛素基因)也可以是一些具有调控作用的因子。2、目的基因获取的方法：从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因化学方法直接人工合成目的基因（一）从基因文库中获取目的基因基因文库定义

2、（见课本P9）种类基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）基因组文库的构建过程基因组文库限制酶供体细胞的全部DNA大量DNA片段拼接到载体上导入受体细胞扩增cDNA文库的构建过程mRNA单链DNA双链DNA反转录cDNA文库互补合成如何从基因文库中找到所需要的基因？依据目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性。（二）利用PCR技术扩增目的基因PCR的全称：聚合酶链式反应PCR的原理：DNA复制(体外)PCR技术扩增目的基因的前提条件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。模板原

3、料引物Taq酶控制温度——目的基因DNA——四种脱氧核苷酸——如单链DNA分子片段——热稳定的DNA聚合酶——PCR仪自动调控PCR的条件：（高温变性，低温复性，中温延伸）PCR的过程：目的基因DNA受热变性而解链(90-95℃)引物与DNA单链互补结合(55-60℃)DNA聚合酶催化延伸合成新链(70-75℃)（高温变性，低温复性，中温延伸）PCR技术与DNA复制的比较比较项目PCR技术DNA复制相同点原则碱基互补配对原料4种游离的脱氧核苷酸模板DNA双链不同点解旋方式加热解旋酶场所体外细胞核酶Taq酶细胞内的DNA聚合酶结果大量的DNA片段形成

4、整个的DNA分子（三）用化学方法直接人工合成条件：仪器：基因较小，核苷酸序列已知。DNA合成仪二、基因表达载体的构建复制原点+目的基因+标记基因+启动子+终止子各元件具有怎样的功能？标记基因：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因。复制原点：载体自我复制的起点1、元件：启动子：终止子：位于基因尾端，转录停止的信号位于基因首端，RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA2、基因表达载体的构建目的：a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。b.使目的基因能够表达和发挥作用。载体与基因表达载体的区别：同：二者均有标记基因和复制原点异：表达

5、载体在载体的基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构（其中启动子、终止子对于目的基因的表达（转录步骤）必不可少）载体的组成：复制原点+目的基因插入位点+标记基因基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+标记基因+启动子+终止子三、目的基因导入受体细胞1、什么是转化？2、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？3、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。1.目的基因导入植物细胞常用的方法:农杆菌

6、转化法、基因枪法、花粉管通道法农杆菌的特点:a.易感染双子叶植物和祼子植物。b.具有趋化性。c.Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上1.目的基因导入植物细胞农杆菌转化法的导入过程:构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达２.目的基因导入动物细胞常用的方法:显微注射技术操作程序：a.先提纯含目的基因的表达载体b.从动物体内取出卵(受精卵）c.显微注射仪进行显微注射d.将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体3.目的基因导入微生物细胞原核生物的特点:繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。大肠杆菌的转

7、化过程:用Ca2+处理细胞增加细胞壁的透性，与细胞膜无关→感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定1、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA？3、利用抗体－抗原杂交检测的原理是什么？目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA上？检测1：检测方法:DNA探针：用放射性同位素等作标记的含有目的基因的DNA片段。DNA分子杂交技术用DNA探针与基因组DNA杂交。目的基因是否转录出mRNA？检测2：检测方法:分子杂交

8、技术用DNA探针与mRNA杂交。检测3：检测方法:抗原—抗体杂交目的基因是否翻译