去氢甲睾酮ELISA试剂盒的研制

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1、动物医学进展，２０１２，３３（９）：６１－６５ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ去氢甲睾酮ＥＬＩＳＡ试剂盒的研制姚萍，董英，王云，张勋（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江２１２０１３）摘要：以实验室自主研发的一株能稳定分泌去氢甲睾酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株为基础，应用ＥＬＩＳＡ原理研制去氢甲睾酮残留快速检测试剂盒，并对试剂盒特性进行测定。结果表明，该试剂盒标准曲线的回归方程为ｙ＝－０．２０５５ｘ＋０．５１６（Ｒ２＝０．９９３１），线性检测范围为０．１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ，半数抑制浓度（ＩＣ５０）为３．２０ｎｇ／ｍＬ，对猪肉加标样品的检测回收率在８７．４

2、１％±５．４４％～１１０．７０％±２．０５％之间，试剂盒检测与去氢甲睾酮结构类似物丙酸睾酮酯、群勃龙的交叉反应率均小于１％；试剂盒在４℃能稳定保存６个月。说明试剂盒能够应用于食品中残留去氢甲睾酮的快速检测。关键词：去氢甲睾酮；单克隆抗体；酶联免疫吸附试验；试剂盒中图分类号：Ｒ４４６．６１文献标识码：Ａ文章编号：１００７－５０３８（２０１２）０９－００６１－０５去氢甲睾酮（１－ｄｅｈｙｄｒｏ－１７ａ－ｍｅｔｈｙｌｔｅｓｔｏｓｔｅｒ－１材料与方法ｏｎｅ，ＤＭＴ）是一种人工合成的蛋白同化类激素，又１．１材料名大力补、美雄酮，化学名为１７β－羟基－１７α－甲基雄１．１．１实验动物和杂交瘤细胞

3、株Ｂａｌｂ／ｃ小鼠由甾－１，４－二烯－３－酮。在临床上ＤＭＴ可用于再生障碍扬州大学实验动物中心提供；ＤＭＴ－ＢＳＡ完全抗原、［１－２］性贫血、男性发育迟缓、烧伤处理等疾病的治疗。稳定分泌去氢甲睾酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ＤＭＴ还具有促进动物体内营养物质沉积和改善生１Ｄ６Ｆ１０Ｂ４，江苏大学食品营养与安全实验室自制。产性能的作用，在畜牧业上被用作动物饲料添加剂，１．１．２主要试剂去氢甲睾酮、丙酸睾酮酯、群勃［３－４］以促进动物生长，提高产量。但蛋白同化激素作龙，Ｓｉｇｍａ公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠ＩｇＧ为饲料添加剂应用于畜牧生产时，会在动物体内残（ＨＲＰ－ＩｇＧ），Ｇｅｎｅｓｃｒ

4、ｉｐｔ公司；Ｔｗｅｅｎ２０，国药集团留。当人们长期食用含有该药物残留的动物性食品化学试剂有限公司；透析袋（截留分子质量１４ｋｕ），时，会严重危害人类健康，如导致肝功能障碍，生殖上海华美生物工程公司；试验所用其他试剂均为分［５］功能紊乱，增加患心血管疾病的风险等。因此，研析纯。制灵敏、高效、稳定的ＤＭＴ残留检测方法非常重０．０６ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．８的醋酸缓冲液，包被缓冲要。目前，激素的检测方法主要有ＧＣ－ＬＣ和ＬＣ－液ＣＢＳ（０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．６的碳酸盐缓冲液），稀［６］ＭＳ，具有定量检测、准确可靠的优点，但是其检测释液ＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４的磷酸盐缓冲液）

5、，成本高、样品预处理繁琐、费时耗力，不适于大量样封闭液（含２０ｇ／Ｌ甘氨酸的ＰＢＳ），洗涤缓冲液品的筛检。免疫学检测方法具有灵敏准确，快速简ＰＢＳＴ（含５ｍＬ／ＬＴｗｅｅｎ－２０的ＰＢＳ），终止液（２便等特点，特别适合于小分子药物的现场快速检［７－９］ｍｏｌ／Ｌ的硫酸溶液），酶底物（四甲基联苯胺的柠檬测，近年来得到了较为广泛的应用。酸缓冲溶液），均自行配制。本研究以江苏大学食品营养与安全实验室自主１．１．３仪器设备多功能酶标检测仪ｓｙｎｅｒｇｙ研发的一株能稳定分泌去氢甲睾酮单克隆抗体的杂［１０］［１１］ＨＴ，美国Ｂｉｏ－ＴＥＫｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；万分之一电子天交瘤细胞株为基础，应

6、用ＥＬＩＳＡ原理研制去平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；ＰＨ０５０Ａ型氢甲睾酮残留快速检测试剂盒，并且对其各项指标培养箱／干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；９６孔进行了测定，为开发利用该试剂盒提供试验依据和可拆卸酶标板，Ｃｏｒｎｉｎｇ公司；移液器，德国技术基础。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ；ＷＨ－２微型漩涡振荡仪，上海沪西仪器收稿日期：２０１２－０３－３１基金项目：“十一五国家科技支撑计划”课题（２００６ＢＡＫ０２Ａ０８－１３０）；江苏省自然科学基金项目（ＢＫ２００８２４２）作者简介：姚萍（１９８５－），女，山东德州人，硕士研究生，主要从事酶联免疫吸附法研究。６２动物医学进展２０１２年第３３卷

7、第９期（总第２３１期）分析厂。的ＨＲＰ酶标山羊抗鼠ＩｇＧ，置于３７℃培养箱内温１．２方法育１ｈ，ＰＢＳＴ洗板４次、在吸水纸上拍干；⑤显色：１．２．１单克隆抗体的制备与纯化将冻存的可以每孔加入１００μＬＴＭＢ显色液，３７℃温育１０ｍｉｎ；稳定分泌去氢甲睾酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株⑥终止：每孔加入终止液２ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４５０μＬ。酶１Ｄ６Ｆ１０Ｂ４复苏，置于培养箱中培养。取６周龄左右标仪测定吸光度ＯＤ４５０ｎｍ值。的健康Ｂａｌｂ／ｃ小鼠腹腔注射灭菌石蜡，１