豚鼠过敏试验与中性粒细胞吞噬功能实验(小吞噬)

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1、主讲：张莉莉E-mail:sqjcbwm@126.com病原生物学与免疫学教研室医学免疫学实验二豚鼠过敏试验Theguineapigallergictest主讲：张莉莉E-mail:zhanglili1912@126com病原生物学与免疫学教研室掌握豚鼠过敏实验的原理；一、实验目的2熟悉超敏反应的分类。1二、原理超敏反应Hypersensitivity速发型超敏反应I型超敏反应超敏反应分型II型超敏反应III型超敏反应Ⅳ型超敏反应细胞毒型超敏反应免疫复合物型超敏反应迟发型超敏反应Ⅰ型超敏反应又称为速发型超敏反应，是由特异性的IgE抗体介导的，其主要特征

2、为：出现快，消退也快；出现功能紊乱性疾病，不出现严重组织细胞损伤；有明显个体差异和遗传背景。静息肥大细胞激活后5分钟激活后60分钟荨麻疹哮喘病发作患儿先给豚鼠注射小量异种蛋白，经过一定的潜伏期，动物处于致敏状态。当第二次用较大剂量相同抗原注射豚鼠时，抗原激发豚鼠体内的肥大细胞或嗜碱性粒细胞，致使这些细胞释放多种生物活性介质，豚鼠迅速产生严重的过敏反应及至过敏性休克或死亡。1、豚鼠：体重200g左右的幼小豚鼠；2、变应原：马血清、鸡蛋清；3、其他：生理盐水、无菌注射器、针头、碘酒、酒精、棉球等。三、主要实验材料四、实验步骤1.取豚鼠三只，编号标记；抓取方

3、法：先用右手掌轻轻扣住豚鼠背部，抓住其肩胛下方，以拇指和食指抓住颈部将其轻轻提起。2.致敏：按1：10分别稀释马血清，按照下表操作腹腔注射0.1ml。第一次注射123马血清生理盐水马血清3.发敏：按1：10分别稀释马血清，鸡蛋清，按照下表，心内注射2ml。2-3周后第二次注射123鸡蛋清马血清马血清豚鼠1在注射马血清1-5分钟会出现不安、抓鼻、喷嚏、呼吸困难、竖毛、大小便失禁、痉挛性跳跃，症状严重者在数分钟内死亡。而豚鼠2、3无任何症状。五、结果判断将死亡豚鼠解剖，可见肺脏极度水肿，胀满整个胸腔。1、心脏注射时，首先要固定好动物，然后于心跳最明显之处进

4、针，感觉有搏动、注射器内有回血时再注射过敏原；2、由于动物个体反应性不同，有的反应较轻，可幸免死亡。如果再注射马血清也不出现反应，此称为脱敏状态。但脱敏状态是暂时的，大约2周后又处于致敏状态。六、注意事项中性粒细胞吞噬功能实验(小吞噬）熟悉中性粒细胞的吞噬作用原理和方法通过本实验理解机体的非特异性免疫机制一、实验目的吞噬作用（phagocytosis）：是指细胞从周围环境摄取固体颗粒（如：微生物或较大的细胞残片）的活动。血液中的中性粒细胞是一种小吞噬细胞，通过趋化、调理、吞入和杀菌等步骤，能吞噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物，是机体非特异性免疫

5、的重要组成部分。二、实验原理吞噬细胞（phagocyte）：主要包括中性粒细胞（neutrophil）和单核吞噬细胞（mononuclearphagocyte）两类。大吞噬细胞吞噬细胞的分类小吞噬细胞大吞噬细胞来源：单核巨噬细胞存在部位：血液（单核细胞)、全身结缔组织及小血管的基底膜组织（巨噬细胞）功能基础：富含溶酶体及线粒体功能：吞噬病原微生物（寄生虫等），死亡细胞反应时间及寿命：反应时间长（48h），寿命长小吞噬细胞来源：血液的中性粒细胞存在部位：血液、炎症部位（全身）功能基础：溶酶体，过氧化物酶及杀菌物质功能：主要吞噬化脓菌反应时间及寿命：反应时

6、间短，数分钟到几小时，寿命短，平均数小时吞噬过程示意图中性粒细胞的吞噬作用吞噬过程1、无菌肉汤，白葡菌液，PBS缓冲液，瑞氏-姬姆萨染液。2、注射器,解剖器材,玻片,显微镜等。三、实验器材1.诱导：实验前1小时给小白鼠腹腔注射(头低位、曲形进针)无菌淀粉肉汤2ml，诱导浆液渗出。2.注射：给小白鼠腹腔内注射白葡菌液1ml，轻揉腹部，让小鼠活动。3.取样：注射后30分钟处死小白鼠，抽取腹腔液涂片。4.干燥：室温或者放温箱中完全干燥标本。四、实验方法5.瑞氏-姬姆萨染液染色：滴加3滴A液于标本上，以完全盖住标本为宜，染色40秒。滴加8滴B液，用洗耳球吹出微

7、风使液面产生涟漪，使两液充分混匀，染色5分钟。水洗（勿先倒掉染液，应以流水冲去）。吸水纸拍干水分，干燥。6.油镜镜检五、实验结果小吞噬涂片应薄厚均匀适中，避免过薄或过厚。瑞氏染液染色时间不能过长以免染色过重。六、注意事项附1：小白鼠的抓取和固定通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，翻转后将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。2.腹腔注射腹腔注射：左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，酒精棉球消毒进针部位，右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进

8、行穿刺，针头刺入皮肤后进针3mm左右，接着使注射针头与皮肤呈45°角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜