实验二革兰氏染色及细菌特殊结构观察

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1、实验二细菌的染色细菌的单染色法细菌的革兰氏染色芽孢染色荚膜的染色王海英汪文俊程国军620963031、掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征2、学习细菌的革兰氏染色原理和方法3、了解细菌的特殊形态结构：芽孢和荚膜5、学习训练无菌操作技术。实验目的细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。实验原理1细菌的简单染色常用作简单

2、染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。实验原理(continued)常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。1、菌种枯草芽孢杆菌12～18h培养物金黄色葡萄球菌24h培养物2、染色剂石碳酸复红染液实验材料菌悬液滴加无菌水取菌苔操作步骤涂片固定干燥染色水洗干燥镜检1、涂片取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾取）生理盐水

3、（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从枯草杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2环直接涂于载玻片上。Notes:1）载玻片要洁净无油迹2）滴生理盐水和取菌不宜过多3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。操作步骤（continued）3、固定固定的目的：1）使细胞质凝固，以固定细胞形态；2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。固定方法：涂面朝上，通过火焰数次注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态操作步骤（continued

4、）2、干燥室温自然干燥4、染色◇将玻片平放于桌面上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。◇石碳酸复红染色约1min。操作步骤（continued）5、水洗倒去染液，用洗瓶（或自来水）轻轻冲洗，直至涂片上流下来的水无色为止。Note:水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。7、镜检一般使用油镜（100倍）观察细菌个体形态。操作步骤（continued）6、干燥自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。Notes:必须等涂片完全干后才可滴加香柏油油镜使用完毕，切

5、记按规定步骤擦干净，否则可能损害镜头涂片干燥固定染色水洗干燥镜检操作步骤无菌操作3）擦油镜镜头方法：A）先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油B）用擦镜纸沾少许乙醚酒精（二甲苯），擦拭镜头；C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的乙醚酒精。操作步骤（continued）单染色法只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。2、革兰氏染色常用的有：革兰氏染色法、芽孢染色法、抗酸染色法等。G＋细菌细胞壁G-细菌

6、细胞壁细菌细胞壁的结构G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。G+和G-细胞壁的对比革兰氏染色的实验原理结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色番红复染涂片固定革兰氏染色的步骤1.涂片2.初染：滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖

7、涂面1分钟，后水洗。4.脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒后，立即用流水冲洗。5.复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：观察染色结果并绘图。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌Figure1-AGramstainofGram+Staphylococcuscells.Figure2-GramstainofGram–E.colicells3枯草杆菌芽孢的染色枯草芽孢杆菌（24h培养物）1、制备菌液：加4-6滴蒸馏水于小试管中，用接种环从斜面挑取菌体3-5环于试管中充分混匀。（7人一

8、组）2、染色：加孔雀绿5滴于小试管中。3、加热：沸水浴，15-20分钟。4、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一干净载玻片上，制成涂片。5、干燥、火焰固定6、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。7、复染：加复红染色1-2分钟，水洗，吸水纸吸干。８、镜检：10x，40x、100X（油镜）观察。4细菌荚膜的染色荚膜负染色法：胶质芽胞杆菌1、制片：取洁净的载玻片一块，加一滴黑