二氧化氯在植物外植体表面消毒中的应用研究

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1、环境友好型消毒剂二氧化氯在植物外植体消毒中的应用研究段永波1,周莹莹1,李凤兰2,陈文良3,赵丰兰1,盛玮1,张爱民1,滕井通1,薛建平1,*（1.淮北师范大学生命科学学院/资源植物生物学安徽省重点实验室淮北235000；2.北京必洁仕环保新技术开发有限公司北京101102；3.北京市农林科学院北京100097）*通讯作者。E-mail:xuejp@163.com摘要：外植体表面消毒是植物组织培养中试验材料转为无菌状态的第一环节。目前常用的消毒剂氯化汞和次氯酸钠均有一定弊端，因此探索新型的植物外植体消毒方法非常重要。本研究以二氧化氯消毒剂为研究对象，调查其在禾谷类作物水稻种子、草本植物雪

2、莲果和木本植物石榴外植体消毒上的应用潜力。结果表明，80.0—133.0mg/LClO2处理水稻种子消毒效果较好，出愈率超过90%且所诱导愈伤质量较好；28.6—33.3mg/L二氧化氯处理雪莲果嫩叶后，愈伤组织诱导率接近80%，与0.1%HgCl处理结果相近。石榴的消毒试验中，25—400mg/L二氧化氯处理后嫩叶均脱色褐化死亡，而0.1%HgCl处理组材料生长良好，但二氧化氯低于80%时，部分石榴材料被污染。二氧化氯作为一种环境友好的新型消毒剂，具有替代0.1%HgCl在某些植物外植体消毒上应用的潜力。关键词：二氧化氯；组织培养；水稻；雪莲果；石榴前言在植物组织培养过程中，外植体消毒

3、是材料从带菌环境转为无菌状态的关键步骤。目前植物组培中最常用的消毒剂为氯化汞和次氯酸钠。然而，汞为重金属元素，对环境和人体都有极大的负面影响，同时国家严禁汞消毒废液排入下水道，无害化处理操作繁琐；次氯酸钠消毒反应后产生三氯甲烷等致癌物和氯代酚等毒性物质（Gunten等，2001；刘勇建等，2004），同样威胁着环境安全和人类健康。因此，探索安全、高效和环境友好的新型植物外植体表面消毒剂意义重大。二氧化氯为一种强氧化剂，最早由英国化学家HumphreyDavey通过氯酸钾水溶液和盐酸反应生成，对微生物细胞壁有较强的吸附穿透能力，能有效氧化细胞内含巯基的酶并抑制微生物蛋白合成来杀灭微生物（韦

4、明肯等，2012）。二氧化氯与有机物及无机物反应时均具有很强的选择性，不产生发散性有机卤化物（TOX）和具致癌作用的三卤甲烷（TMH）。因此，世界卫生组织（WHO）推荐二氧化氯为安全消毒物质中的A1级产品（张含松，2003）。关于二氧化氯在作饮用水消毒（代园园等，2011）、农业生产（郑宏海等，2000；王化鹏等，2003；高宝岩等，2008；张明月等，2012）、水产品加工（史建华等，2006）、果蔬保鲜（潘永贵，2003；张顺和和张超，2006）及食品工业（蔡慧农和汤凤霞，2003）等领域应用的研究较多。然而，目前二氧化氯应用于植物组织培养中外植体消毒的报道不多。由于生长环境和材料本

5、身差异，各种植物表面携带菌类和内生菌种类均不同，因此探索各自适合的消毒方法很有必要。本研究以二氧化氯消毒剂为研究对象，调查其在禾谷类作物水稻种子、草本植物雪莲果和木本植物石榴外植体消毒上的应用潜力，为探索新型植物组培消毒方法提供参考。1材料与方法1.1实验材料禾本科植物水稻种子由本研究组种植并保存；草本植物雪莲果幼茎嫩芽取自淮北师范大学南山博士工作站试验地；木本植物石榴幼茎嫩芽采自淮北师范大学校园。二氧化氯消毒剂由北京必洁仕环保新技术开发有限公司提供。氯化汞为武汉福德化工有限公司产品。1.2实验方法1.2.1二氧化氯消毒剂配制将1片A剂药片溶于50ml无菌水，完全溶解后加入5mlB剂，立

6、即盖好瓶盖，5分钟后再加无菌水至500ml，获得二氧化氯消毒剂原液（400mg/L）。将原液进行系列倍数稀释，配制不同浓度二氧化氯消毒剂（现配现用）。具体浓度如下：1倍（200.0mg/L）、3倍（133.0mg/L）、5倍（80.0mg/L）、7倍（57.1mg/L）、9倍（44.4mg/L）、10倍（40.0mg/L）、12倍（33.3mg/L）、14倍（28.6mg/L）、16倍（25.0mg/L）。1.2.2实验材料的预处理挑取饱满、无病斑、胚完整的水稻种子用于表面消毒实验；雪莲果和石榴嫩叶经流水冲洗30min，无菌滤纸吸干表面水分后进行消毒实验。1.2.2外植体消毒方法水稻种子

7、于所试各浓度的二氧化氯溶液浸泡25min（期间不时摇动），吸干表面水分后接种至愈伤诱导培养基NB（Duan等,2012），各培养皿接种20粒种子。雪莲果嫩叶经预处理后置于各浓度的二氧化氯溶液浸泡25min（期间不时摇动），吸干表面水分后接种于愈伤诱导培养基（MS+2,4—D2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8）培养基，各培养瓶接种10个外植体。石榴嫩芽在经预处理后置于各浓度的二氧化氯溶液浸泡25min（期间不时摇