高通量测序-实验基础

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1、高通量测序-实验基础华大基因实验平台胡振飞2012年8月主要内容1核酸提取2琼脂糖凝胶电泳3PCR4DNA纯化1核酸提取1.1什么是核酸？1.2为什么要提取DNA？1.3从哪里可以提取到DNA？1.4如何提取DNA？1.1什么是核酸DeoxyribonucleotideRibonucleotide中心法则GeneticCentralDogma1.2为什么要提取DNA•获取纯度较高的DNA•遗传信息绝大部分存在于DNA中•用于后续研究，如PCR、测序，生物鉴定等1.3从哪里可以提取到DNA1、人，动物组织及器官血液、肾、肝、胸

2、腺等2、植物叶子、种子的胚芽等3、微生物细菌、酵母菌等1.4如何提取DNA1.4.1核酸的物理性质（1）DNA为白色纤维状固体（2）RNA为白色粉末状固体（3）都溶于水，在钠盐比在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。1.4.2核酸的存在形式（1）DNA和RNA在细胞中常以核酸—蛋白复合体（核蛋白）形式存在。（2）核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关（16s）总原则：•应保证核酸一级结构的完整性；•排除其它分子的污染。鉴定：浓度、纯度、完整性鉴定技术：分光光度技

3、术（OD）凝胶电泳技术1.4.3DNA提取基本过程细胞破碎去除杂质纯化DNADNA溶解CTAB法基因组DNA的SDS法提取DNA提其它取方碱裂解法法质粒DNA总煮沸法述的提取非基因组DNA其它的提取线粒体、叶绿体DNA的差速离心结提取合SDS裂解法CTAB材料取上清准备酚/氯仿/异戊醇破碎细胞CTAB离心离心溶解分相取得到离心DNA上清离心离心分相去上清氯仿/异戊醇70%酒精取上清异丙醇CTAB提取缓冲液(Buffer)Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑

4、制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除提取流程材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取流程细胞裂解研磨快速、充分材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：高温温浴时，定时轻柔振荡提取流程核酸分离、纯化蛋白质的去除：酚/氯仿/异戊醇抽提使用变性剂变性（SDS等）高盐洗涤蛋白酶处理提取

5、流程核酸分离、纯化多糖的去除：用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。提取流程核酸分离、纯化盐离子的去除：70％的乙醇洗涤提取流程核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲

6、液溶解•TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase•pH值为8.0，可防止DNA发生酸解提取流程DNA电泳条带图12完整的DNA降解的DNA蛋白污染RNA污染DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因1.DNA中含有蛋白、1.重新纯化DNA，去除多糖、多酚类杂质蛋白、多糖、多酚等杂质2.DNA在溶解前，有对酒精残留，酒精抑2.重新沉淀DNA，让酒策制后续酶解反应精充分挥发3.DNA中残留有金属3.增加70％乙醇洗涤的离子次数（2-3次）问题二：DNA降解。原因1.尽量取新鲜

7、材料，低温保存材1.材料不新鲜或反复料避免反复冻融冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在2.未很好抑制内源核解冻前加入裂解缓冲液对酸酶的活性3.细胞裂解后的后续操作应尽量策3.提取过程操作过于轻柔剧烈，DNA被机械4.所有试剂用无菌水配制，耗材打断经高温灭菌4.外源核酸酶污染问题三：DNA提取量少。原因1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.动植物要匀浆研磨充分；G1.实验材料不佳或量少＋菌、酵母裂解前先用生物2.破壁或裂解不充分对酶或机械方式破壁策3.高温裂解时，时间适当延长3.沉淀不完全4.低温沉淀，延长沉淀时间4.洗涤时DNA

8、丢失5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒主要内容1核酸提取2琼脂糖凝胶电泳3PCR4DNA纯化琼脂糖凝胶电泳2.1什么是凝胶电泳？2.2琼脂糖凝胶电泳的原理是什么？2.3琼脂糖凝胶电泳如何操作？2.1什么是凝胶电泳凝胶电泳是一项广泛应用于分析核酸和蛋白的技术琼脂