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1、基因工程在治疗1型糖尿病方面的研究进展与发展【摘要】近年来,随着人们对糖尿病本质的深层次揭示和现代分子生物学手段的发展,糖尿病,尤其是1型糖尿病基因治疗的内容不断增加。本文总结了利用合适的启动子载送胰岛素原的cDNA,刺激新的B细胞生成以达到恢复胰岛素的生理性分泌及改善或避免破坏B细胞免疫应答的1型糖尿病基因治疗进展，并展望其未来发展方向。【关键词】1型糖尿病；基因治疗；病毒载体；B细胞工程自上个世纪以来,胰岛素的发现和其类似物的不断发展挽救了无数1型糖尿病患者的生命。但外源性胰岛素及其类似物的补充治疗存在需要多次注射、严密
2、监视血糖及无法按生理需求分泌等缺陷。随着新病毒载体的成熟运用,载送方式的不断改进以及治疗思路的不断扩展,科学家们开始尝试用基因治疗技术来治疗1型糖尿病。1型糖尿病(Type1diabetesmellitus,T1DM)的主要病因与自身免疫对于机体胰岛B细胞的破坏有关。目前研究人员尝试通过以下三种策略来平稳控制血糖。首先是直接载送具有合适启动子的胰岛素原cDNA到胰腺以外的部位(通常是肝),通过异位分泌胰岛素来维持正常血糖水平。其次是通过刺激新的B细胞的生成来促使胰腺恢复原来的功能。第3种思路则是改善胰岛B细胞的自身免疫反应。
3、下面就1型糖尿病胰岛素基因治疗研究现状分别从上述3个方面作一综述。1.利用合适的启动子载送胰岛素原的cDNA1型糖尿病最简单直接的基因治疗法是通过载送胰岛素原的cDNA来替代死亡B细胞的功能。通常选择肝细胞为基因送载的目的部位,这是由于肝脏具有合成糖代谢相关酶及运载蛋白的功能。目前已用于此基因转移的载体有:(1)逆转录病毒载体。(2)脂质体载体。(3)腺相关病毒载体等。逆转录病毒载体由于构建简单,宿主范围广,可整合入宿主细胞基因组中获得稳定表达等优点,而成为目前各种基因治疗实验中应用最广泛的载体。有研究显示,将含有人胰岛素原
4、基因的重组逆转录病毒载体注入大鼠门静脉后,可在肝脏获得5%~15%的基因转移效率,并可使其表达持续6个月,阻止大剂量STZ诱导的糖尿病鼠高血糖、体重下降、酮症酸中毒以至死亡［1］。然而逆转录病毒载体也有其缺点,它只能感染分裂期的细胞,在体内直接基因转移时需要采取部分肝切除等方法促进细胞分裂增殖,这使其在活体动物以及人的直接应用受到限制,另外,它缺乏靶向性,随机整合,不可避免的产生安全性问题。传统的中性脂质体载体是将磷脂、胆固醇或其它脂类的乙醚溶液加入DNA溶液中,通过处理得到带DNA的脂质体小泡,DNA被包裹在脂质体膜内部,
5、可与细胞膜融合被细胞内吞而实施基因转移。这种方法在胰岛素基因活体直接基因转移研究中应用较早。八十年代已有学者将含有胰岛素基因的质粒与中性脂质体作用后注入大鼠体内,发现在肝组织中可检测到转入基因的存在,并获得一过性血糖下降和血浆胰岛素水平升高。1987年起出现了一系列阳离子脂质体转染试剂,DNA通过与阳离子之间的相互作用形成DNA－脂质体复合物再被细胞捕获并最后表达,这大大提高了脂质体的基因转染效率。目前认为,影响脂质体活体直接基因转移效率的因素有:(1)启动子因素。有研究比较了巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、腺病
6、毒启动子及胸苷激酶(TK)启动子引导氯霉素乙酰基转移酶基因在大鼠体内转移表达效率,发现CMV启动子最高,而TK启动子效率最低。还有研究发现,在各种启动子引导荧光酶(luc)基因表达的实验中,CMV启动子可在肌肉中获得最高表达效率。(2)脂质体的组成因素。研究发现在活体直接基因转移时,含有胆固醇的脂质体可获得最高转移效率。(3)DNA与脂质体的比例。Thierry等认为经静脉基因转移时DNA与脂质体的最佳比例为0.08(wt/wt),而Egilmez等认为这个比例应在11~14(ug/nmol)之间(4)DNA的用量。Thie
7、rry等在研究luc基因经静脉注入小鼠体内后的表达情况时发现,组织中luc水平随DNA用量增加而逐渐增高,当DNA用量增至100ug以上时,组织中luc水平不再继续增高甚至开始下降。当前在基因治疗领域,脂质体尤其是阳离子脂质体介导基因转移已成为一种最具创新性的、高效的转染技术。然而大量研究表明,脂质体介导的活体直接转移的基因表达是一过性的,如何充分利用它的高效性和安全性,使其介导转移的基因长期稳定表达成为学者们今后需要研究的重要课题。腺相关病毒(AAV)载体由于其位点特异性整合而在近年倍受重视。与其它病毒性载体相比,AAV载
8、体具有以下优点:AAV无致病性,人类为自然宿主,安全性较高;AAV基因组可克隆入质粒,载体构建简单;AAV载体可将外源基因定点整合于人类19号染色体长臂,基因表达稳定;AAV颗粒稳定,可通过离心浓缩提高病毒滴度达1012cfu/ml。最近的研究表明,腺病毒是最好的有效载体系统。它可以选择性
