western blot操作规程-相关试剂配制

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1、8SDS-PAGE电泳适用与Bio-RadMiniProtean3类电泳槽一、准备工作1试剂蛋白marker；丙烯酰胺；双丙烯酰胺；Tris碱；甘氨酸；甲醇；冰乙酸SDS；过硫酸铵；甘油；溴酚蓝；β-巯基乙醇；考马斯亮蓝R-250；TEMED；正丁醇2仪器与耗材电泳系统；移液枪；电子天平；pH计；恒温加热器；EP试管；量筒（500ml,250ml,100ml,20ml）；烧杯（500ml,50ml）；玻璃引流棒；储液瓶；二、操作步骤a.灌制分离胶(6cm×8cm×1.5mm):1.组装好凝胶模具，确保不会发生凝胶渗漏。2.凝胶配制所用组分如下：按10

2、%配制配制Separatinggel所需各成分的体积/mL15%12%10%2gels1gel2gels1gel2gels1gel30%acrylamidemix105846.663.331.5MTri,pH8.852.552.552.5ddH2O4.82.46.83.48.044.0210%SDS0.20.10.20.10.20.110%APS0.10.050.10.050.10.05100%TEMED0.010.0050.010.0050.010.005Total201020102010（注：先加入，然后再从冰箱取出加入）3.加入APS和TEME

3、D后，轻轻振荡烧杯使其混匀。（注：一定要将加入的溶液充分混匀，以免胶凝固的不均匀）4.小心地用移液器将分离胶沿隔片加入模具。（注：动作缓慢，以免产生气泡）5.当加入的凝胶溶液7.4mL时，轻轻在溶液上覆盖一层1mL正丁醇饱和的水，使胶面平整。6.等40min，待凝胶聚合后，在分离胶和水之间会出现一个清晰的界面。（注：此时可制备蛋白样品。具体见“c.样品的制备”）b.灌制浓缩胶1.浓缩胶配制所需组分如下：按3.9%配制配制Stackinggel所需各成分的体积/mL5%3.9%2gels1gel2gels1gel30%acrylamidemix1.70

4、.851.30.650.5MTri,pH6.82.51.252.51.25ddH2O5.72.856.13.0510%SDS0.10.050.10.0510%APS0.050.0250.050.025100%TEMED0.010.0050.010.005Total1051052.倒出并用滤纸吸干覆盖在分离胶表面的水层。（注：先加入，然后倒出水，最后再从冰箱取出加入）3.加入APS和TEMED后，轻轻振荡烧杯使其混匀。4.小心地用移液器将浓缩胶沿隔片加入模具，直至凝胶到达模具的顶部。5.斜着插上梳子。（注：动作缓慢，尽量不要产生气泡）6.放置30min

5、左右，待凝胶聚合后，小心拔出梳子。（注：拔出梳子时，要垂直拨出，以免损坏制好的泳道）7.将凝胶放入电泳槽中，在槽中加入1×电泳缓冲液。（注：1，缓冲液所加入的量，玻璃内液面高于玻璃外液面，玻璃内的，液面高于短玻璃低于长玻璃。2，尽量吸尽玻璃内液面的气泡，以免电泳过程中造成短路）c.样品的制备：1.将蛋白样品和samplebuffer在一1.5mL管中混匀，于95℃加热5min（或100℃3min）。2.离心1sec，点样入泳道。d.电泳：1.接好电极，电流应流向阳极。2.150V恒压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部1～5mm处终止。时间约60-75m

6、in。（注：此时配制电转缓冲液，剪NC膜和滤纸）3.取出凝胶板，小心拆卸。e.染色与脱色：（注：此步骤按实验需要选择是否操作）考马斯亮蓝染色：1.戴上手套以免手指印留在胶上，将胶移入考马斯亮蓝溶液中，于振荡摇床上缓缓振荡染色2h以上（一般3～4h），染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器。2.加入考马斯亮蓝脱色液，振荡脱色。Westernblot操作过程一、准备工作：1试剂：Tris碱；甘氨酸；甲醇；预染marker(PRO-STAINTMPrestainedProteinMarkerⅠ,mbi)Whatman滤纸（普通实验室用的不行，要厚的，夹膜

7、用的）一抗；二抗；Western试剂盒(170-5013,Bio-Rad)；硝化纤维膜(Amersham)；X光片(最好是柯达的)；显影粉（国产，洗普通照片的即可）；定影粉（国产，洗普通照片的即可）；2仪器及耗材：膜标记笔；电转系统；冷却系统；磁力搅拌器；水平脱色摇床；锥型瓶（50ml,2个）；托盘；保鲜膜；二、操作步骤（除非特别提到，以下操作均在室温水平摇床上缓缓振荡进行）：1.SDS-PAGE变性电泳；2.电转移：a．将电转用到的膜和滤纸（1张膜+6张滤纸/一块胶）浸泡在电转缓冲液中10min。（注：此时将分离胶从玻璃板中取出并浸泡到电转缓冲液中

8、）b．按3张滤纸—胶—膜—3张滤纸的顺序包好，并将滤纸四边按胶的大小剪掉，确保胶两边的滤纸无法接触到。C．将