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1、..,Vol16,o3‘生物工程进展》1996N多下砰写蘸获耸,、,,、嘴‘哈甲甲,侧尸娜户甲卿州产侧炸试基因探针及其在昆虫学上的应用王瑛陈晓峰,0(中国科学院动物研究所北京10080)摘要八十年代以来以塞因工程技米为主导的分子生物学研究大大丰富了人们对生命过程和本质的认识。基因工程技术在昆虫学研究中。日益受到重视一个新兴的学科昆虫分子生物学。—已经形成。在分子生物学研究中基因探针是必不可少的重要的工具由于在系统进化上人和哺,,乳类遗传距离较近其基因探针具有较大的通用性所以医学发展起来的人基因探针为哺乳动物。而无奋推动物
2、的分子生物学研究一向十分薄弱,因此可用于研究带来了许多方便,昆虫的基因探针来源困难研究者常需在实验设计初期对已有的众多基因探针进行预选或自。。己制备所以基因探针的选择和使用对昆虫分子生物学研究至为关键本文就昆虫,,学常用的基因探针的类型标记方法特别是应用等方面选择若干典型实例作一些介绍和评述。关键词DNA探针;昆虫学;昆虫分子生物学l基因探针探针有一部分自身发生复性。但探针一般都是,。基因探针(probe)是一个DNA(或RNA)过量的自身复性并非是严重的问题,.它的核DNA,片段昔酸顺序与所要探测的基因相同有些研究者也
3、使用单链探针这样,。,。或相似因此可与目标基因形成杂交链同时可提高探针的利用率制备单链DNA探针的,探针还必须带有能够很方便检出的标志o如放方法主要是采用单引物通过Klenw酶的作’Z‘25,,。射性同位素P或1标记或化学发光物质标用在模板DNA上合成标记的互补链另一种。,,探针一旦与目标基因形成杂交链人m,记这样方法是以特异的RNA为模板通过逆转录酶们就能知道相应基因的存在或找到它们的位,,。DNA,的作用合成标记的互补DNA即然后。,。。置所以要求探针必须很纯并具专一性用碱去除mRNA模板2基因探针的类型2.2RNA
4、探针,依照来源不同基因探针可以分为以下几,RNA探针有许多优点最主要的是RNA〔‘〕:。,类与DNA杂交更为稳定因其自由能低可以在.21DNA探针,更严格的条件下杂交和洗涤从而能得到特异DNA探针一直是一种非常重要的基因探性较强的信号。此外,RNA还是单链分子,不会,。针并广为使用通常它们是克隆的DNA片段发生自身复性。,直接制备特定的R但是NA分,1,或聚合酶链反应(PCR)的产物长度多在50子并进行标记却非常困难需借助特别的质粒b。,。p以上这类探针往往为双链DNA在使用前载体。,.需经变性在与样品DNA杂交时双链D
5、NA23寡核昔酸探针28,,用寡核昔酸作探针非常方便因可利用切口再用大肠杆菌DNA聚合酶分子内所兼DNA。,合成仪合成寡核昔酸探针的优点是可以具的外切酶活性和聚合酶活性一边去除原有,。,。按研究者的设计制备且均为单链缺点是只能DNA的核昔酸残基一边补进新的核昔酸新,进行末端标记每个探针分子一般只能带上一的核昔酸来自反应系统中外加的四种脱氧核昔,。,,个标记物故灵敏度受到影响一般说来17~酸三磷酸(dNTP)如果其中含有一种或两种a3,,28个碱基聚合体(mer)是寡核昔酸探针常用的在位为P标记的dNTP则新合成的DNA。
6、,“,。长度在设计上应考虑许多参数如选择序列的链上即含有许多这类P放射性标记物这种方,,,特异性G+C含量防止二聚体形成及任何二法在早期无疑是一种重要的标记技术可获得级结构的存在等等。这可借助计算机专用程序较高比活性的标记DNA,即>10‘emp加g。。进行设计DNA..312,ranoriming):么4免疫探针随机引物(dmp法用,这类探针严格说并不是基因探针是用来随机顺序的六聚脱氧核昔酸混合物与待标记的。,,也在这里介绍变性DNA退火这些随机序列以高频率出现探测基因产物的由于其重要性。DNA。,no一下免疫探针是利
7、用特异的抗体探测样品中在链各处作为引物它们在Klew的,。某种抗原的存在所以免疫探针本质上就是抗酶的作用下可以引发新链合成若在掺入前体,。,体探针也就是蛋白质探针由于这类探针系探dNTP中存在标记物即可合成高比放射性的,,“Z,“测样品中某一抗原的存在因此它们主要应用DNA探针对P标记物其比活性可达10/拜g于分析基因表达的最终产物多DNA。此法目前比较流行。肤或蛋白.·。—。313PCR合:PCR,质所以免疫探针是间接的基因探针在基因成在反应中若加a一,,一,表达和调控研究中有一种非常重要的分析技入上述1一2种PdNT
8、P也可使DNA产物,n,,,术即Wester印渍分析它所用的就是免疫探带上放射性标记其比活性也非常高与随机引。针。在特异基因筛选中,如果研究者对所研究的物法相当本法的优点是待标记的DNA不必,,预先纯化直接用少量克隆的DNA作PCR的基因序列一无所知免疫探针就几乎是唯一的。选择了。此时要求研究者在设计实验时应将基模板
