简并PCR及其应用

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1、生物技术通讯!"#!"##"$%&’(&)#"*+’)!),-./0123’/145678499:文章编号YT99AK9994Z499:[94K9T4K9:综述简并;L$及其应用史兆兴!王恒樑!苏国富!黄留玉军事医学科学院生物工程研究所!北京T999T摘要!简并;L$技术是根据同源蛋白的氨基酸序列扩增到同源基因的核苷酸序列!具有独特的优点"成功进行简并;L$的关键是设计好两组引物库和对反应条件进行优化"由于简并;L$自身的特点!在新基因的克隆#基因表达检测#病毒检测和基因组研究中有其广泛而独特的应用"关键词!简并;L$$简并性引物中图分类号Y]^3文献标识码!

2、C!"#"$"%&’"()*&$+,’-&../,0&’,1$!"#$%&’()*+,-./01"2+,(3*&+,-!415’(65-"4/017*5(85&?F@D@E@=/_(D/@=GO?/0/>P‘a=DbD?>T999T‘*OD?623-’%&0’-4#O=6=/_<=>=?=76@=;*$DF@O6@@O=?EG0=/@D<=F=dE=?G=F/_>=?=F67=/e@6D?=6GG/7@/@O=6JD?/6GD/EFI7/@=D?1#O=/I@DJDg6@

3、D/?/_7=6G@D/?G/??67=@O=h=P_6G@/7F_/7@O=FEGG=FF6GG/JI0DFOJ=?@/_<=>=?=76@=;*$1#O=6II7/6GOi6FiD<=0P6?/_?/c=0>=?=F‘@O=6?60PFDF/_>=?==jI7=FFD/?‘@O=D?FI=G@D/?/_cD7EF6?<@O=F@E

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4、I7DJ=7简并;*$!<=>=?=76@=;*$"是49世纪A9年代初建立的用样可以得到43S种不同的序列#在引物中有越多的-或$或’$于细胞遗传学中特异扩增B’C的技术方法##=0=?DEF等人也称引物的简并程度就越大#其为简并寡核苷酸引物;*$!<=>=?=76@=/0D>/?EG0=/@D<=HI7DJ=<引物设计是简并;L$的关键环节$值得仔细考虑#设计引物;*$M2N#本文中将凡是应用简并性寡核苷酸引物进行之前$最好画出要扩增基因所在基因家族所有成员的比对图$标$B);K;L$"的;L$反应都称之为简并;L$#出保守的氨基酸残基$并标记出编码每个氨基酸的

5、密码数目#设简并;L$根据密码子存在的简并性设计寡核苷酸引物$进计简并;L$引物需要两个必要条件$一是两段保守的氨基酸序行聚合酶链式反应#由于此种;L$不需要知道要扩增B’C片段列或B’C序列!保守性不必为T99U"$保守氨基酸区段最好不的核苷酸序列$因此该技术倍受青睐$在多个领域都有广泛的应要以丝氨酸%精氨酸和亮氨酸为主’二是蛋白’端序列已知$一用#本文就简并;L$的基本原理及引物设计方案%存在问题及解般蛋白末端测序得到的序列足够用来引物设计#决办法和应用研究进展做一简述#在引物设计中$最重要的是要尽量降低引物库的简并性程度$一般简并性程度在T999VT9999倍

6、之间较好#减少引物简2基本原理及引物设计并性的方法主要有&!选择最佳的引物位点&在氨基酸序列中选定合适的引物位点需要考虑两点$一是此位点最好在编码最保简并;L$与一般;L$的不同之处在于$一般;L$中的引守氨基酸的密码子序列上$二是虽然氨基酸保守性不高$但其密物是用给定的核苷酸序列设计的两条特定的引物$而在简并码子简并程度要低’"用次黄嘌呤作为(中和)碱基&次黄嘌呤是;L$中用的是由多条不同核苷酸序列组成的混合引物库#其基@$’CF中自发产生的可以与胞嘧啶%胸腺嘧啶和腺嘌呤形成碱基本原理就是根据氨基酸序列设计两组带有一定简并性的引物对的嘌呤碱基#尽管此碱基与腺嘌呤形

7、成的碱基对非常不适合库$从不同生物物种中扩增出未知核苷酸序列的基因#简并引物双链B’C的结构$但在螺旋结构的突出部分存在此碱基对是一库是由一组引物构成的$这些引物有很多相同碱基$在序列的好种能量的补偿$有利于B’C结构的稳定#在简并;L$引物设计几个位置也有很多不同的碱基$只有这样$才会和多种同源序列中$在:种碱基都需要合成的位置用次黄嘌呤代替$每使用一次发生退火$以实现;L$扩增#例如&次黄嘌呤就可以将引物库简并性降低至TW:#但是会发生&X,的#7ICFI#O7C06,0P,0?,0E错误配对$因此必须假定在引物其他位置的精确碱基配对会克3Q#,,,C-C*