国内大鼠Morris水迷宫实验现状与分析_封敏

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·2170·辽宁中医杂志2011年第38卷第11期国内大鼠Morris水迷宫实验现状与分析1，2111封敏，卢圣锋，张承舜，余曙光(1.成都中医药大学，四川成都610075;2.怀化医学高等专科学校，湖南怀化410008)摘要:Morris水迷宫实验是评价动物学习记忆能力的经典行为学实验。分析近5年国内大鼠Morris水迷宫实验的现状，指出在实验方案和参数选择中所存在的问题，并结合国内情况和NatureProtocols推荐方案，提出了一套实验参考方案。关键词:大鼠;Morris水迷宫中图分类号:R－33文献标识码:A文章编号:1000－1719(2011)11－2170－03［1］学习记忆障碍疾病是现代医学的治疗难点也是神rhees等在NatureProtocols上推荐的大小为2.1m。经科学的研究热点，中医药在学习记忆障碍疾病如阿平台一般用透明PVC材料制成，目前应用于大鼠实验［4－5，12］尔兹海默病、血管性痴呆等的防治中占有重要地位，对的多为直径10cm的圆形平台。在国外，5cm平其治疗机制的研究亦逐步开展。在神经科学领域，评台也被用在大鼠二次反向空间加缩小平台实验(Spa-［13］估药物或疗法对动物学习记忆功能的影响主要采用行tialdouble－reversalwithasmallerplatform)中。国［11，14－15］为学实验。Morris水迷宫实验是其中的经典实验之内文献中实验用水的温度以(26±2)℃较多，一，近年来在中医药研究中也应用得越来越多。它是研究表明当水温和室温(19～22℃)平衡时，大鼠表现［1］一种强迫实验动物游泳，学习寻找水下平台的实验，于最佳。文献中常提到在水中加入脱脂奶粉或无毒染［4］1981年由英国心理学家RichardG．Morris设计，主要料，目的是使水变浑浊、隐藏水下平台，也为了视频用来评价动物的空间学习记忆能力。Morris水迷宫实追踪的需要，加入奶粉亦能消除气味线索。由于种系验能提供较多实验指标，具有可靠的敏感性，且操作简差别，并非所有大鼠都适用于Morris水迷宫实验，SD便。因其包涵的内容较多，在实验过程中也易受多种大鼠和Wistar大鼠是目前国内主要使用的品种，雄性［4，7，16］因素的干扰，实验方案和指标的选择不当可导致实验应用多于雌性，有实验表明，同龄大鼠中雄性成［17］结果的失真。笔者以“Morris水迷宫”为主题词，检索绩优于雌性。Morris水迷宫实验环境要求安静、光CNKI、VIP、万方数据库中近5年发表在核心期刊的相线柔和平衡、空间参考物充足，以排除听觉诱导作用，关文献，分析目前国内大鼠Morris水迷宫实验的现状，利于大鼠的视觉参考学习和视频追踪系统的良好工结合NatureProtocols的推荐方案进行相应探讨，以期作。实验者如暴露在动物视野之内，则应在实验过程为实验者提供一定参考。中保持位置固定。1实验设备2实验方案Morris水迷宫由圆形水池、平台、动物和视频追踪定位航行实验和空间探索实验是Morris水迷宫实系统组成。训练强度相同的情况下，水池大小是决定验最基本的程序，此外还有适应性训练、可视平台实验动物学习记忆任务难度的重要因素。在国外，大鼠以及其他附加实验等。国内进行较多的程序是适应性Morris水迷宫实验中直径(2±0.2)m的水池应用较训练、定位航行实验和空间探索实验。［1－3］［4－11］多，国内以(1.5±0.1)m多见。CharlesVVo-适应性训练能减少应激因素(水环境、抓取等)对［9］SaltielAR，PessinJE．SignalingPathwaysininsulinaction:molecular［13］尤巧英，李成江．部分炎症因子与胰岛素抵抗［J］．国外医学:内targetsofinsulinresistance［J］．JClinInvest，2000，106(2):165－分泌学分册，2004，24(3):183－185．169．［14］SunZ，ArendtCW，EllmeierW，etal．PKC－thetaisrequiredfor［10］TaoR，GongJ，LuoX，etal．AMPKexertsdualregulatoryeffectsonTCR－inducedNF－kappaBactivationinmaturebutnotimmaturethePI3Kpathway［J］．JMolSignal，2010，5(1):1．Tlymphocytes［J］．Nature2000，404(6776):402－407．［15］RahmanI．Regulationofnuclearfactor－kaPPaB，activator［11］祝炼，袁莉．胰岛素信号转导与肝胰岛素抵抗［J］．世界华人消化Protein－1，andglutathionelevelsbytumornecrosisfactoralphaand杂志，2004，12(10):2420－2423．dexamethasoneinalveolarepithelialcells［J］．BioehemPharmacol，［12］童国玉．IκВ激酶β与糖尿病［J］．国外医学:内分泌学分册，2000，60(8):1041－1049．2003，23(1):24－26．［16］易屏，陆付耳，陈广，等．游离脂肪酸诱导3T3－L1脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机制［J］．中国糖尿病杂志，2008，16(4):221－收稿日期:2011－03－01224．基金项目:国家自然科学基金资助项目(81072866);四川省青年科技基［17］YuanM，KonstantopoulosN，LeeJ，etal．Reversalofobesityanddiet金资助项目(09ZQ026－025)inducedinsulinresistancewithsalicylatesortargeteddisruptionof作者简介:封敏(1982－)，女，湖南永州人，讲师，博士研究生，研究方IKKβ［J］．Science，2001，293(5535):1673－1677．向:针灸对神经康复的作用。［18］CaiD，YuanM，FrantzDF，etal．Localandsystemicinsulinresist-通讯作者:余曙光(1965－)，男，研究员，博士研究生导师，研究方向:针anceresultingfromhepaticactivationofIKK－betaandNF－kappa灸作用原理。B［J］．Natmed2005，11(2):183－190． 辽宁中医杂志2011年第38卷第11期·2171·正式实验的干扰，国内进行较多。一般在正式实验前相比之下，“游泳路程”能更好消除速度的影响。“累一天进行，大鼠面朝池壁放入水中，游泳120s后，放入积游泳距离”是动物到平台距离的总和，通常由计算［14，18－19］温暖干燥的笼子结束训练。包含平台停留的训机每一秒或每几毫秒测量一次，最后相加，可评价动物［20］练还能加快动物对水迷宫任务的学习。游泳轨迹跟目标的接近程度。“朝向角”是动物入水因所需要的动物能力、动机、策略都与正式实验相开始游泳的方向与“入水点———平台”连线所成的夹同，可视平台实验常被用作控制程序，评估非空间参考角，故又称“初始角”。有研究表明“逃避潜伏期”、“游学习因素，排除运动、感觉缺陷等对认知成绩的影响。泳路程”和“累积游泳距离”三指标相关程度较高，而［1］平台置于水面上2cm或虽低于水面，但在其上方置一“朝向角”弱于前三者。“搜索策略”也是国内应用小旗，其余操作与正式实验相同。在国内，可视平台实较多的指标，将其分为四个方式，搜索效率由高到低［35－36］验尚未受到应有的重视，少数采用过的实验以都将其为:直线式、趋向式、随机式、边缘式。国外尚有［11，21－23］［2］放在正式实验之后进行。然而，在正式实验之七型的分法，效率最高直线式，最低趋触式。“学习［2］前进行不仅能排除动物的非空间参考因素干扰，还能坡”(slopeoflearning)是一个较新的指标，由“逃避剔除由于运动或感觉缺陷不能完成水迷宫任务的动潜伏期”而获得线性回归曲线，用来检测学习效应和物，达到动物筛选的目的，最大程度保证正式实验成绩学习速度，在神经可塑性和神经损伤研究中有重要价的真实性。值。定位航行实验又叫隐匿平台实验，是动物通过空间空间探索实验中，“穿越平台次数”使用最频繁。视觉线索找到水下平台，从水中逃生的程序，用于动物然而实验中，动物穿越平台的发生率较少，甚至为0，空间学习能力的检测。鉴于实验条件的差异，Nature尤其是平台缩小或者水池较大的时候，计算机有时亦Protocols推荐大鼠定位航行实验时间为:半径1.2m水会发生漏计的情况，用其来评价动物的空间记忆能力池3天，2.2m水池5天，每只动物每天4次实验，4个不就可能造成假象。“穿越有效区次数”或许可以弥补同方位各一次，单次游泳时限120s，实验间隔时间(ITI)这一缺陷，“有效区”是以平台为中心增加一定半径后15s。国内不同实验间操作程序差异较大。目前，国内的圆形区域，扩大了平台面积。而“穿台次数”或许还水池以直径(1.5±0.1)m较多，时间从2天到6天不可用于动物记忆精度的检测。“原平台象限游泳路［5，7，23－25］［5－6，8，26］［24，27］等，每天实验次数亦有2～4次、8次程/总路程”、“原平台象限游泳时间/总时间”的使用［18，28］等，其中8次×4/5天的程序较为多见。动物单次仅次于“穿台次数”。它们是将动物在原平台象限游［4，10，21，29－30］［5，11，24］游泳时限有60s到180s，以120s最多。泳的路程或时间除以总路程或总时间所得到的比值。［6，27］实验间隔时间15s～30min不等，其中15s对动物空“平均游泳距离”是动物游泳总距离与游泳时间的比［1］间学习最有利。值。研究表明“原平台象限游泳路程/总路程”、“原平空间探索实验评价动物空间记忆能力。国内实验台象限游泳时间/总时间”、“平均游泳距离”和“朝向［1］操作与NatureProtocols基本一致:实验在最后一次定角”是比“穿台次数”更可靠的指标。其他还有如位航行实验后24h进行，撤除平台，大鼠自由游泳“首次到达原平台时间”等。［1］60s，每只动物进行一次。也有部分实验在定位航行4小结［31］［14，32］实验后48h进行的，游泳时间亦有120s的。从文献分析可知，国内Morris水迷宫实验尚存在除以上程序外，Morris水迷宫实验还有很多附加一些问题，如操作程序差异较大，忽视控制程序的重要程序，如反向空间实验、二次反向空间加缩小平台实验性，指标选择存在缺陷等。这些问题可能导致不同实等。反向空间实验将平台移至与原平台呈180°的位验得到的结果无法进行较好比较，甚至造成某些实验置，动物入水方位也相应调整到与原方位呈180°的地结果失真。一些文献对实验过程的描述不够清楚，也方，余操作同定位航行实验，24h后进行空间探索实让读者无法评估实验质量。［1，13］验。反向空间实验可以检测动物的再学习能力。实验程序的选择，应充分考虑自身设备的情况。二次反向空间加缩小平台实验将平台再次移回至最初再者，对实验者而言，理想的操作程序应该简便而高位置(原定位航行实验的位置)，并且缩小平台面积效。我们在实验中发现，可视平台实验能起到较好的(如直径10cm减至5cm)，余操作不变。本实验增加适应训练作用，额外的训练程序可以省略。关于实验了实验难度，除检测动物再学习能力外还可观察动物强度的问题，动物在一段时间的学习后，其认知成绩会学习记忆的精确程度。在国外，反向空间实验近年来达到极限不再上升，极限以后的训练对于实验者来说［33］有增加的趋势，国内进行尚少。则是多余的，尤其在受试动物较多的情况下会大大加3实验指标重实验负担。相比之下，国外的动物学习时间少于国Morris水迷宫实验可提供众多指标，有统计目前内，省时省力的实验程序能减轻实验者负担，缩短实验国内采用最多的是定位航行实验的“逃避潜伏期”、进程。是否进行附加实验，取决于实验目的，难度增加“搜索策略”、“游泳距离”和空间探索实验的“穿越平的任务对动物轻微认知障碍的检测更为敏感。国内实台次数”、“原平台象限游泳路程/总路程”、“原平台象验在指标的选择上与国际存在一些差异，有的实验者［34］限游泳时间/总时间”。忽略了指标本身的缺陷，以致未能选取可靠性最高者，定位航行实验中，“逃避潜伏期”是应用最早和最或者指标使用过于单一，这些都可能造成实验结果的多的指标，它是动物从入水到爬上平台的时间。其优偏差。点是采集方便，在没有视频追踪设备的情况下，也可手通过对国内Morris水迷宫实验的现状分析，参照动记录，缺点是易受动物游泳能力(如速度)的影响。NatureProtocols方案，建议:大鼠水迷宫实验时应选择 ·2172·辽宁中医杂志2011年第38卷第11期直径2.1m左右的水池，水温19～22℃。如现有设备(9):3228－3235．为直径1.5m左右的水池，建议应选实验程序及其顺［14］岳静，王钰，张广军，等．β－淀粉样1－40致阿尔兹海默病大鼠序为:(1)可视平台实验3～4天，4次/d;(2)定位航模型N－甲基－D天冬氨酸受体及亚型表达分析［J］．中国康复行实验3～4天，4次/d;(3)空间探索实验1次，于最医学杂志，2010，25(6):531－535．［15］冯昶，范广勤，冯建高，等．蛋氨酸、维生素C联合对铅染毒大鼠后一次定位航行实验后24h进行。在实验指标的选择海马一氧化氮合酶活力、一氧化氮水平的影响［J］．毒理学杂志，上，较可靠指标为:定位航行实验的“逃避潜伏期”、2008，22(1):8－10．“游泳路程”、“累积游泳距离”和“搜索策略”;空间探［16］王瑞婷，申兴斌，左彦珍．黄芩茎叶总黄酮对AD模型大鼠学习、索实验的“原平台象限游泳路程/总距离”、“原平台象记忆能力及神经元损伤的影响［J］．山东医药，2008，48(44):限游泳时间/总时间”、“平均游泳距离”;建议多个指30－31．标联合使用，相互印证。其他附加实验和指标可根据［17］朱曼迪，张洁，杜久钢，等．性别因素对大鼠水迷宫测试成绩的影实验者的目的选取。我们在实验中还发现，不同年龄响研究［J］．实用中医内科杂志，2008，22(7):58．段的大鼠学习速度有所不同，其所需的训练强度亦不［18］陈涛，章军建，余芬，等．促红细胞生成素对慢性脑缺血大鼠空间相同，加之本实验会导致动物体力、体温的快速丧失，学习记忆能力的影响［J］．武汉大学学报:医学版，2006，27(2):不同年龄段大鼠尤其是老年大鼠的实验程序是否应不225－228．同，目前尚无研究。［19］李国才，招伟贤．复方麝香对氯胺酮麻醉后老年大鼠学习记忆及本文主要从实验方案和指标选择方面探讨大鼠外周血IL－6，TNF－α变化的影响［J］．广东医学，2007，28Morris水迷宫的实验过程，未涉及数据的处理和分析，(10):1592－1594．［20］JosephNunez．MorrisWaterMazeExperiment．JournalofVisualized也未涉及小鼠的实验操作。总之，在中医药防治学习Experiments，2008，19．记忆障碍疾病的研究中，高质量的Morris水迷宫实验［21］黄春霞，杨俊卿，卢伟，等．短期丰富生存环境对中老年大鼠空间将会是一个强大的行为学检测工具。学习能力的作用及性别差异［J］．重庆医科大学学报，2009，34参考文献(5):521－524．［1］CharlesVVorhees，MichaelTWilliams．Morriswatermaze:procedures［22］徐刚，江乐盛，于建云，等．多重脑震荡对大鼠认知行为及多巴胺forassessingspatialandrelatedfomsoflearningandmemory［J］．Na-能神经元的影响［J］．中国老年学杂志，2009，29(19):2496－tureProtocols，2006，1(2):848－858．2498．［2］HilaireJ．Thompson，DavidG．LeBold，NiklasMarklund，etal．Cogni-［23］李葳，朱彬，叶青，等．低频率重复性经颅磁刺激对大鼠空间记忆tiveevaluationoftraumaticallybrain－injuredratsusingserialtesting的影响［J］．四川大学学报:自然科学版，2006，43(6):1384－intheMorriswatermaze［J］．RestorNeurolNeurosci，2006，24(2):1388．109－114．［24］余昌胤，张华．雷公藤多甙对慢性脑低灌注大鼠学习记忆能力的［3］EffectofMPEPinMorriswatermazeinadultandoldrats［J］．Pharma-影响［J］．中国康复医学杂志，2007，22(12):1064－1066．cologicalReports，2007，59:88－93．［25］李玉娟，彭书峻，万朝权，等．慢性疼痛对幼鼠学习记忆行为及海［4］陈娟，左红艳，王德文，等．不同波段电磁辐射对大鼠学习记忆的马Bcl－2mRNA、脑源性生长因子mRNA的影响［J］．中华儿科影响［J］．中医行为医学科学，2006，15(12):1061－1063．杂志，2005，43(6):444－448．［5］赵建军，刘勇，陈新林，等．胞二磷胆碱对大鼠局部脑缺血后空间［26］邓朝珲，钟敏，王登高，等．蛋白激酶C与微波辐照致学习记忆学习和记忆的影响．［J］南方医科大学学报，2006，26(2):174－损伤的关系［J］．现代预防医学，2007，34(2):395－396，400．176．［27］柯荔宁，王玮，张更，等．不同脑缺血方式对大鼠学习记忆能力的［6］赵天智，常耀明，李金声，等．大鼠急性一氧化碳中毒后迟发性脑影响［J］．医学科学，2005，14(10):879－881．病模型的建立［J］．第四军医大学学报，2006，27(11):1024－［28］单培彦，高静，季燕，等．促红细胞生成素对血管性痴呆模型大鼠1026．［7］何平，王爱国，夏涛，等．PBDE－47单独和与PCB153联合染毒对认知功能脑保护作用及海马α－微管蛋白表达的影响［J］．临床大鼠神经发育的影响［J］．环境与健康杂志，2008，25(9):763－神经病学杂志，2008，21(2):119－122．766．［29］沈伯雄，渠兴乾，程志军．氯胺酮对新生鼠学习记忆功能的长期［8］杨伯宁，谭国鹤，韦力，等．促肾上腺皮质激素释放因子在Meynert影响［J］．上海交通大学学报:医学版，2010，30(2):196－199．基底核中对大鼠学习记忆的影响［J］．神经解剖学杂志，2005，21［30］朱丽霞，董志，廖红，等．粉防己碱对大鼠拟痴呆模型脑保护作用(5):503－506．研究［J］．中国老年学杂志，2005，25(1):78－80．［9］李训军，严家川，潘峰，等．REM睡眠剥夺对大鼠额叶皮质5－TH［31］李永军，王群．初次搜索策略对大鼠Morris水迷宫实验成绩的影的含量及学习记忆的影响［J］．重庆医学，2009，38(10):1151－响［J］．中国现代医学杂志，2004，14(21):7－10，14．1152，1154．［32］卢舜飞，孙丽娜，沈佳，等．黑木耳多糖对抗大鼠慢性缺血性脑损［10］王勇，段云友，周宁，等．彩色多普勒超声重复照射对仔鼠学习记伤［J］．中国病理生理杂志，2010，26(4):721－724．忆能力的影响［J］．中国超声医学杂志，2008，24(10):868－870．［33］远慧茹，刘存志，于建春，等．针刺对多发梗死性痴呆(MID)大鼠［11］靳大力，刘苹，吴锡南，等．出生前暴露甲基对硫磷与氯氰菊酯混空间参考记忆能力的影响［J］．天津中医药，2005，22(3):229－配农药对大鼠子代神经行为毒性的影响［J］．环境与职业医学，232．2007，24(1):46－49．［34］陈罗西，郭玲玲，李亮．Morris圆形水迷宫的应用及其相关检测［12］周萍，李勇辉，马建军，等．中药复方对铅染毒大鼠学习记忆障碍指标分析［J］．辽宁中医药大学学报，2008，10(8):55－57．的改善作用［J］．心理科学，2005，28(6):1490－1492．［35］刘平，马丽慧，罗国凯，等．经颅脑超声造影对大鼠记忆能力影响［13］HarryW．Broening，LaRondaL．Morford，SandraL．Inman－Wood，et的实验研究［J］．中国超声医学杂志，2008，24(3):193－196．al．3，4－Methylenedioxymethamphetamine(Ecstasy)－Induced［36］赵志英，胡海涛，冯改丰，等．人脑源性神经营养因子基因修饰神LearningandMemoryImpairmentsDependontheAgeofExposure经干细胞移植对痴呆大鼠学习记忆的改善［J］．中国修复重建外duringEarlyDevelopment［J］．TheJournalofNeuroscience，2001，21科杂志，2005，19(5):331－444．