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1、一，分组实验对象：A549细胞干预措施：含有0、5000ug/ml茶氨酸的细胞培养液分组：8个组别，即对照组，5000ug/ml茶氨酸培养15min、30min、1h、2h6h、12h、24h组。二，实验试剂5X电泳缓冲液；tris15.1g,glycine94g,SDS5.0g,加入800ml蒸馏水，搅拌溶解。加蒸馏水将溶液定容至1L后，室温保存。用的时候稀释成1*的就可以了。10*TBS缓冲液；tris24.2g,NaCl80g。加蒸馏水将溶液定容至1L后，调PH7.6，室温保存。用的时候稀释成1*的就可以了。5X转膜缓冲液配制：Gly14
2、．4g、Tris-base30g、SDS1.875g，加蒸馏水至1000ml，4℃保存。1X转膜缓冲液配制：200mL转膜缓冲液母液（5X）+200mL甲醇＋600mL蒸馏水封闭液配制：1*TBST缓冲液95ml脱脂奶粉5g,4℃保存,一周内使用。5X加样缓冲液:1.0mol/LTris缓冲液1.25ml，甘油4ml，SDS0.5g，巯基乙醇250ul，溴酚蓝25mg，H2O定容至5ml混匀备用。按1:4比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮10min混匀后再上样1.0mol/LTris缓冲液:Tris12.114g，H2O定容至100ml.PH6.
3、81.5mol/LTris缓冲液:Tris18.17g，H2O定容至100ml.PH8.810%sds:Sds10gH2O定容至100ml.10%AP:AP0.1g,H2O定容至1ml.10%下层胶:H2O5.9ml30%丙烯酰胺5ml1.5mol/LTris缓冲液3.8ml10%SDS150ul10%AP150ulTEMED6ul5%上层胶:H2O4ml30%丙烯酰胺1ml1.5mol/LTris缓冲液0.75ml10%SDS60ul10%AP60ulTEMED6ul三，实验操作过程1蛋白样品制备1、倒掉培养液，向培养皿中加入裂解液，通常6孔
4、板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min2、用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中（注意冰上操作）3、于4℃下12000rpm离心5min。4、将离心后的上清分装转移倒1.5ml的离心管中放于-80℃保存。2蛋白含量的测定1.取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mgBSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。2.取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20μl25mg/ml蛋白标准，加入980μl稀释液
5、即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可以-20℃长期保存。3.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5mlBCA试剂A加100μlBCA试剂B，混匀，配制成5.1mlBCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。4.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。5.加适当体积样品
6、到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。6.各孔加入200μlBCA工作液,37℃放置20-30分钟。注:也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。7.测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度3SDS－PAGE电泳1、清洗玻璃板，玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。2、灌胶：配10％下层胶（15ml，两块胶，每块胶在6.5ml左右），加
7、入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后用水压平，静置45min3、胶凝后，弃去水，用水冲洗2次，并用吸水纸将水吸干。4、等待胶凝期间可计算含50-100ug蛋白的溶液体积即为上样量5、配5％的上层胶（6ml，两块胶）,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，静置45min6、将玻璃夹取出，在流水中冲洗，洗去正反面余胶，在水流中拔掉梳子，放入电泳箱。7、上样Marker6μl样本20-30μl通入电源，电压80V，电流300mA，功率50W，时间1.5hour。(电泳30分钟后可调节电压到120V)电泳至溴酚
8、兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。4转膜1、配制转膜液2、事先将PDVF膜放在甲醇溶液中激活，同时将4X2层滤纸放入转膜液中，尽量压出其中气体。3、夹子
