细胞的离心分离基础和分离实例

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1、细胞的离心分离基础和分离实例（主要内容源自文献1）YU.2005利用细胞的特性[尺寸、密度、电特性、表面(抗原)性质，光散射特性等等]可以用各种方法分离和纯化细胞。离心分离是利用不同尺寸和密度的细胞在离心场中沉降行为的不同，从组织匀浆或血液中分离纯化的技术。用离心技术分离和纯化细胞主要依赖的方法是差分离心、速率－区带密度梯度离心、等密度离心和利用特殊转头的细胞浮选离心。下面的表格概括了细胞离心分离纯化主要方法：（文献1）分离依据方法离心加梯度形状使用工具局限性优点名称速度细胞密度平衡比较高连续或不连续甩平转头，固定离心力较细

2、胞易聚合；应用面较（ρ）等密(100～梯度角转头，区带转大，等密度面较广度离30,000×头纯样品区带心g）可能重叠沉降速度差分1～300无梯度角式为主低分辨率快速，简易（细胞平离心×g均直径d密单位1g连续梯度特殊分离容器容量50×简单，价廉6度ρ）重力10个细胞，加速特殊装备，度沉时间长降速率20～1，连续梯度，线性甩平转头或区带中等分辨大容量用区带转－区000×g或等速度沉降转头率，容量范头，小容量用甩平带离梯度，ρ梯度介围宽转头，后者操作简心质≤ρ细胞单离心100～无梯度细胞浮选转头装置费用高快速，高分辨率，浮选3,

3、000×g（日立或处理量较大Beckman）细胞离心分离纯化概述：1.利用细胞密度差异进行分离：一般的做法是在连续或者不连续（阶梯）梯度液上表面铺样品，梯度的范围应该包含被分离的细胞的密度，经过离心达到平衡后各种细胞沉降在它们各自的等密度区形成比较纯的单一细胞分布区带。这种等密度离心法可以用于制备或分析用途。用于制备时要注意在匀浆中可能有多种不同密度的细胞，如果它们的密度差很小，离心后会造成各个细胞区带之间的重叠。因此要优先考虑利用细长离心管，合适的密度范围；较少的加样量（离心管容量的2％～3％）；或者用同一个甩平转头进行2

4、～3次分离；每一次分离的最大、最小密度梯度差减少（即减少梯度斜率；分别用凸指数及凹指数梯度曲线进行分离；用不同的等渗液改变不同细胞在梯度介质中的浮密度（文献2）。在离心管中细胞匀浆可以铺在预形成的连续或不连续梯度液的上部或铺在梯度液1的中间某一位置，后者可以在离心过程中让部分密度较小的细胞上浮，让一些密度较大的细胞沉降，减少了沉降距离，从而缩短了离心时间。不连续的阶梯梯度常用于血细胞分离或肝细胞分离，作血细胞分离时梯度材料可选择Ficoll-metizoate，肝细胞分离可选择Nycodenz或metrizamide(文献3

5、)。2.根据不同细胞的沉降速度差异进行分离：由于细胞在梯度介质中的沉降速度和细胞直径的平方成正比，和细胞与介质密度差一次方成正比（参考讲座文献2－“实验离心技术的基本计算”）所以影响沉降速度的首要参数是细胞尺寸，其次才是密度。2d（s－r）2沉降速度ν=wr，ν的单位是（厘米/秒）18h公式中d为细胞直径（cm）3σ为细胞密度（克/cm）η为介质粘性系数3ρ为梯度介质密度（克/cm）ω为转头旋转角速度r为细胞所在位置与旋转中心的距离（cm）i.差分离心：在不存在密度梯度条件下分离细胞是这种方法的主要特点，差分离心可以是利用地

6、球重力（1g），也可以是利用低速离心分离组织匀浆。在重力或离心力作用下一些比较大的细胞沉降速度较快，当它们已变成沉淀时，大部分比较小的的细胞由于沉降速度慢而仍留在上清液中。很明显在大的细胞变成沉淀时一部分接近离心管底的较小细胞在离心力也已变成沉淀，第一次离心可以使最大颗粒细胞全部沉淀但沉淀中少量的较小细胞降低了分辨率和纯度。我们可以用第一次离心同样转速和时间将第一次沉淀稀释后再离心（每次都要用同样的缓冲液稀释）（这叫在离心机中“洗”），重复数次可以得到较纯的大颗粒沉淀。各次上清液合并以更高转速离心，重复以上过程数次，就可以得

7、到各种较纯的不同大小的颗粒的沉淀。如果利用某些特殊梯度材料（如dextran,percoll,Nycodenz,metrizamide等）作为支持液来做血细胞或其他生物体细胞分离，可以用较小的离心次数得到较好的结果。（文献4）。ii.依赖重力加速度沉降：不用离心机，将细胞悬液铺在预形成密度梯度上表面，在重力作用下细胞沉降。一般设计的密度梯度采用较小的密度变化范围，其最大密度小于密度最大的细胞密度。不同密度的细胞以很慢的速度按不同层次沉降。在最大密度细胞达到底部之前进行分部收集。（收集的方法参照“离心技术讲座”文章3a）iii

8、.利用速率－区带密度梯度离心法分离细胞：在本质上与重力沉降是一样的，但是利用离心场来减少分离的时间。小容量样品用68甩平转头，大容量样品用区带转头，对于较少数量的细胞（10～10），并且不同细胞的沉降速度有较大差异，用甩平转头离心分离可以得到很满意的结果。对于较大数量的9细胞（＞10）可以