5RACE Takara

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1、CodeNo.6107研究用5'-FullRACEKitwithTAP说明书v201211Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存2●试剂盒原理3●特异性引物的设计要求3●试剂盒特点4●RNA样品制备4●试剂盒使用注意4●使用ControlHL60TotalRNA时的5′RACE实验例5●实验样品的5′RACE操作方法8●实验例12●Q&A12●制品说明本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增cDNA5′末端全长的试剂盒。使用RT-PCR方法扩增目的DNA时，一般很难得到全长的cDNA片段，在基因工程研究中，分析遗传基因的全长cDNA序列十分重要。RACE（RapidAmplifi

2、cationofcDNAEnds）法能有效解决这一问题。5′-FullRACEKitwithTAP能够通过已知的cDNA序列，高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的5′末端的全长序列。本试剂盒应用了“去帽法”原理，TobaccoAcidPyrophosphatase（TAP）可以去掉mRNA的5′帽子结构，使用T4RNALigase将5′RACEAdaptor连接到mRNA的5′端后，可以使用5′RACEAdaptor上的引物与已知序列部分的引物进行RT-PCR反应，高特异性地扩增cDNA5′末端的全长序列。本试剂盒中含有完成5′RACE操作的主要试剂。试剂盒中使用的ReverseT

3、ranscriptaseM-MLV（RNaseH-）经过了本公司的特殊改良，反转录性能良好，无RNaseH活性，大大增加了反转录性能。结合使用TaKaRaLATaq（CodeNo.RR002A）进行PCR扩增时，其5′RACE的扩增性能大大优于其他同类产品。本试剂盒应用了套式PCR原理，增加了PCR扩增的特异性与灵敏度，可以对少量样品或低丰度的基因进行5′RACE实验，并且对长片段的5′RACE扩增具有明显优势。5′RACEInnerPrimer中含有BamHI酶切位点，为克隆提供了方便。使用TaKaRaLATaq扩增得到的PCR产物的3′端附有一个“A”碱基，可直接克隆于T-V

4、ector中。试剂盒中提供的ControlHL60TotalRNA可作为ControlRNA，使用ControlPrimer可扩增HumanProhibitin（PHB）基因5′末端约750bp的DNA片段。本试剂盒具有以下特点：1.扩增cDNA的5′末端全长序列。应用了“去帽法”原理，可以有效扩增cDNA的5′末端全长序列。2.高灵敏度的5′RACE扩增。采用了套式PCR法，对低丰度的基因或极少量的RNA样品同样可以进行5′RACE实验。3．高特异性的5′RACE扩增。套式PCR法的使用，大大提高了5′RACEDNA片段扩增的特异性。4．长片段5′RACE扩增。试剂盒中使用了本

5、公司特殊改良的M-MLV（RNaseH-）反转录酶，反转录性能良好，使长片段的RT-PCR扩增成为了可能。●制品内容（10次量）ForRNATreatedReactions（10次量）：AlkalinePhosphatase（Calfintestine）（16U/μl）10μl10×AlkalinePhosphataseBuffer（MgCl2Free）50μlTobaccoAcidPyrophosphatase（0.5U/μl）10μl10×TAPReactionBuffer10μl5′RACEAdaptor（15μM）10μlT4RNALigase（40U/μl）10μl5×

6、RNALigationBuffer*180μl40%PEG#6000200μl3MCH3COONa（pH5.2）400μlNACarrier40μlRNaseInhibitor（40U/μl）35μlReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）（200U/μl）10μl5×M-MLVBuffer20μldNTPMixture（10mMeach）10μlRandom9mers（50μM）10μlRNaseFreedH2O2×1ml-1-For5′RACEPCRReactions（50次量）：1×cDNADilutionBufferII400μl5′RACEO

7、uterPrimer（10μM）100μl5′RACEInnerPrimer（10μM）100μlForControlReactions（5次量）：ControlHL60TotalRNA（1μg/μl）*210μl5′RACEControlOuterPrimer（10μM）*210μl5′RACEControlInnerPrimer（10μM）*210μl*1此Buffer带有颜色，长时间保存有时会产生沉淀，请离心后取上清使用，不会影响反应性能。*2用于扩增HumanProhib