限制性内切酶考点小结

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1、限制性内切酶考点盘查限制性内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对相关的知识先进行归纳，才有利于解答试题。1限制性核酸内切酶的基本知识①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。化学本质为蛋白质。②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同

2、时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。2限制性核酸内切酶的难点解析2.1目的基因切割要点归纳①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。2.2质粒切割要点归纳①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们

3、需要的目的基因和质粒的连接。切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。2.3限制性核酸内切酶的说明不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末

4、端也相同。2.4酶切割后的DNA片段的连接如果是用一种限制性内切酶切割质粒表达载体和目的基因,不可以防止载体和目的基因的自身环化,两个DNA片段连接产物有：目的基因—目的基因；目的基因—载体；载体—载体。这些连接物可以环化。如果是用两种不同的限制性内切酶切割载体和目的基因,可以防止载体和目的基因的自身环化,同时可以防止目的基因和质粒表达载体在酶切后不发生任意连接。两个DNA片段连接产物也有：目的基因—目的基因；目的基因—载体；载体—载体。这些连接物也可以环化.。3试题解析说明：为了突出重点，高考试题中只是把与限制性内切酶有关的内容保留

5、，其余内容都进行了省略。例1(2008高考海南卷)图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有、、三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行。（2）用上述3种连接产物

6、与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是。解析由于目的基因和质粒用同一种限制性内切酶切割，故切割得到的粘性末端一样，得到的DNA片段有两种，两两连接有三种情况。EcoRI酶切割时会破坏四环素抗性基因，因此插入了目的基因的连接产物就不能抗四环素了。由于EcoRI、BamHI两者酶切割后的

7、粘性末端不同，故目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端不会发生任意连接答案（1）目的基因—载体连接物载体--载体连接物目的基因--目的基因连接物分离纯化（2）载体--载体连接物目的基因--载体连接物、载体--载体连接物（4）EcoRI和BamHI例2(2008高考江苏卷第32题)将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗,饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。限制酶AluIEcoRIPstISmaI切割位点AG↓CTTC↑GAG↓AATTCCTTAA↑GCTGCA↓GG↑ACGTCCCC↓GGG

8、GGG↑CCC请根据以上图表回答下列问题:(5)对符合设计要求的重组质粒T进行酶切。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。①采用EcoRI和PstI酶