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时间:2019-05-14
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1、高压液相色谱(HPLC)基本概念和理论http://www.2345.com/?k1035835一、基本概念和术语1.色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器,所得到的信号-时间曲线,又称色谱流出曲线(elutionprofile)。基线(baseline)--经流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起
2、,柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种:前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。拖尾因子(tailingfactor,T),用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T<0.95为前延峰,T>1.05为拖尾峰。峰底-基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peakheigh
3、t,h)-峰的最高点至峰底的距离。峰宽(peakwidth,W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ半峰宽(peakwidthathalf-height,Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2=2.355σ标准偏差(standarddeviation,σ)-正态分布曲线x=±1时(拐点)的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小,分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高;反之,σ大,峰形胖、柱效低。峰面积(peakarea,A)-峰与峰底所包围的面积。2.定性参数(保留值)死时间(deadtime,t0)--
4、不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积(deadvolume,V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分:进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据,Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程,其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展,这3部分体积应尽量减小。V0=F×t0(F为流速)保留时间(retentiontime,tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。保留体积(retentionvolume,VR)--从进样开始到某组分在柱后出
5、现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR=F×tR调整保留时间(adjustedretentiontime,t’R)--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reducedretentiontime)。在实验条件(温度、固定相等)一定时,t’R只决定于组分的性质,因此,t’R(或tR)可用于定性。t’R=tR-t0调整保留体积(adjustedretentionvolume,V’R)--扣除死体积后的保留体积。3.柱效参数理论塔板数(theoreticalplatenumber,N)--用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充
6、状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上,如果各组分含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽,峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用,因为半峰宽更易准确测定,尤其是对稍有拖尾的峰。N与柱长成正比,柱越长,N越大。用N表示柱效时应注明柱长,如果未注明,则表示柱长为1米时的理论塔板数。(一般HPLC柱的N在1000以上。)若用调整保留时间(t’R)计算理论塔板数,所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)。理论塔板高度(theoreticalplateheight,H)--每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。4
7、.相平衡参数分配系数(distributioncoefficient,K)--在一定温度下,化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的浓度之比。分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关,也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中,K有不同的概念:吸附色谱法为吸附系数,离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数),凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。在条件(流动相、固定相、温度和压力
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