《CR扩增产物的分析》PPT课件

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1、PCR扩增产物的分析GelelectrophoresisRestrictionendonucleaseMolecularhybridizationNucleicacidsequencePCR扩增产物的电泳分析琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测（定性）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中可用于科研及检测分析琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶

2、解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等凝胶浓度选择琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围电泳缓冲液常用三种缓冲液Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀TAE：缓冲容量低，但

3、价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解10×TBE缓冲液的配制配方Tris108克EDTA9.3克硼酸55克H2O至1000mlpH应为8.0～8.2临用时用水稀至0.5×TBE（20倍稀释）核酸电泳的指示剂指示剂：溴酚兰二甲苯青溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb核酸电泳的指示剂二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与

4、双链线性DNA大致相当琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率2Kb1.6Kb载样缓冲液指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液作用：①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置③使样品呈色，使加样操作更方便核酸电泳的染色剂最常用的染色剂溴化乙锭银染色核酸电泳的染色剂溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的

5、EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察核酸电泳的染色剂银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收电泳电泳装置电泳仪电泳槽灌胶模具等电泳仪普通电泳仪高压电

6、泳仪电泳槽水平平板垂直平板电泳方法用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段（可配制1.2～1.7%）电泳方法配制琼脂糖凝胶及倒胶0.5×TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至60℃(需要时可加入EB)，倒入电泳槽中，待凝固向电泳槽中倒入0.5×TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去）电泳方法上样与通电在DNA样品中加入0.2

7、体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为1—5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳，一般200～400bp的PCR产物50V电压，电泳20～40min电泳方法结果观察紫外仪上观察电泳带及其位置并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长度仅相差0.2%（即500b

8、p中的1bp）的核苷酸分子即能分离聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N，N，N，N‘一四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的不同浓度丙烯酰胺和DNA有效分离范围丙烯酰胺（%）有效分离范围（bp）溴酚兰*