植物单细胞培养概论

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1、植物单细胞培养概论一、植物单细胞培养相关概念1、植物的单细胞培养：在适宜的条件下，一个来自已分化的根、茎、叶等组织的细胞，经过离体培养可以发育成同其亲本一样的完整植株。植物组织培养技术的重要理论基础是植物细胞的全能性植物的单细胞培养，在无菌和人为控制外因的条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整个植株的技术。2、愈伤组织：原指植物体受伤时产生于伤口周围的组织。现多指切取植物体的一部分，置于含有生长素和细胞分裂素的培养液中培养，诱导产生的无定形的组织团块。3、外植体：把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官叫

2、做外植体愈伤组织例图二、植物组织培养特点及其意义特点：①培养条件可以人为控制②生长周期短，繁殖率高③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制意义：①研究细胞生理代谢过程及各种影响因子；②用于植物品种的改良；③用于植物次生代谢物质的生产三、细胞培养的主要内容1、单细胞培养（Singlecellculture）2、悬浮培养（Suspensionculture）3、细胞培养实验室器材简介第一节：单细胞培养（Singlecellculture）单细胞的分离单细胞的培养方法影响单细胞培养的因子单细胞的分离从外植体中直接分离单细胞从愈伤组织中分离

3、单细胞通过原生质体再生法获取单细胞*叶片是分离单细胞的最好材料*机械法：第一种方法：用刀片刮叶片第二种方法：叶片研碎、离心酶解法：机械法第一种方法：用刀片刮叶片撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞机械法第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心从愈伤组织中分离单细胞将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团伙单细胞，然后用适当孔径的细胞筛过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。通过原生质体再生法获取单细

4、胞外植体、愈伤组织或细胞团通过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁得到原生质体。单细胞培养培养方法液体浅层培养法固体平板培养法看护培养法微室培养法1、液体浅层培养法将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单细胞和小细胞团培养在浅层液体培养基中液体培养基用途：主要用来增殖细胞。特点：有利于有毒物质的扩散；有利于气体交换；不利于定点观察；单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系。2、固体平板培养法2-1含义及用途：含义：是将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。该方法是Bergmann(1960年)首创。用途：是

5、为了分离单细胞无性系，研究其生理、生化遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。2-2特点操作简便；分离单细胞系比液体浅层培养容易；培养细胞气体交换不畅。固体培养基2-3平板培养的基本技术(1)、培养基配制1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液=0.7%琼脂条件培养基。（2）悬浮细胞密度的调制平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为1×10³~100×10³个/ml。初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。调制方法：若悬浮液中细胞密度高，则加培养液稀释；

6、若悬浮液中细胞密度过低，则通过离心使细胞沉淀后，取一定量的上清液使其达到所要求的密度。若悬浮液与培养基以1:4混合，则应把悬浮液的细胞密度调到5×10³~500×10³个/ml。（3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35℃）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板，盖上培养皿盖。用封口膜封严培养皿。(4)培养：26℃置暗处培养21天。低倍显微镜观察，记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。植板效率=×100%该平板上接种的细胞数每个

7、平板上形成的细胞团数2-4平板培养必须注意的方面（1）选用的培养基，无论是否条件培养基，必须是能够在低的初始植板密度下使细胞生长。（2）不要选用处在静止期过久的细胞。因为处在分裂旺盛时期的细胞才有最高的植板率。（3）在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物种类而不同。如：烟草细胞适宜的为5~10×10³个/ml,若低于此数则植板率显著下降。（4）接种时培养基的温度要控制，一般不超过35℃。3、看护培养法3-1看护培养的含义及用途含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。用途；诱导形成单细胞系。Muir(19

8、54)首先用此法培养出烟草单细胞株。Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞系。看护培养（Nurseculture）图示：NursecallusFilterpaperSinglecell