虾夷扇贝热胁迫基因克隆及甲基化状态研究

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4、ctenyessoensis学科、专业:食品科学隶属学院:食品学院研究生:史井运指导教师:孔繁东教授2015年6月摘要摘要虾夷扇贝（Mizuhopectenyessoensis）自20世纪80年代初引入中国后迅速开展增养殖研究和实践。最近十年，虾夷扇贝出现了成长速度慢，苗产量低及大规模死亡等问题，使虾夷扇贝养殖业受到了巨大的经济损失，严重制约了我国贝类产业的发展。因此对贝类免疫系统的探索能有助于我们有效的控制扇贝疾病，从而更好的发展贝类养殖业。本文从已构建的虾夷扇贝cDNA文库中获得了2个ESTs序

5、列，并设计相关的特异性引物，结合RACE技术克隆得到了这2个胁迫基因的完整cDNA序列，并对获得的全长序列进行了结构分析和功能预测。本论文针对这2个胁迫基因所做的主要研究内容如下：1.虾夷扇贝酚氧化酶基因克隆、序列分析及表达特性研究酚氧化酶是一种含铜的金属酶，广泛分布于微生物、动植物及人体中。该酶在无脊椎动物先天免疫防御中起着重要的作用。本文用分子克隆技术得到了虾夷扇贝酚氧化酶(TYR)cDNA基因全序列（GenBank登录号为KM408317），并利用Real-TimePCR方法分析了酚氧化酶基因

6、在虾夷扇贝不同组织中表达概况以及鳗弧菌(Vibrioanguillarum)注射后不同时段的相对表达量。实验得到的酚氧化酶基因全长1850bp，其包括长为1470bp的开放阅读框，编码489个氨基酸，5’UTR和3’UTR分别为37bp和343bp。实时定量分析研究显示，酚氧化酶基因在肝胰腺、外套膜、肾、闭壳肌、鳃和血中都有表达，其中外套膜表达最高。鳗弧菌注射后6h，TYR基因表达量显著低于对照组，而注射后12-36h，TYR基因表达量显著高于对照组，这一数据说明该基因可能在免疫过程中发挥重要作用2

7、.虾夷扇贝热休克蛋白60基因克隆、序列分析、表达及甲基化状态研究HSP60(heatshockprotein60，热休克蛋白60)作为高度保守的热休克蛋白家族的一员，不仅可以在应激状态下帮助其他蛋白正确折叠并恢复天然构象，还可作为危险信号作用于天然免疫系统。基于HSP60的转录组序列设计特异引物，采用RACE技术成功克隆获得虾夷扇贝热休克蛋白60（HSP60）cDNA全序列（GenBank登录号为KP398510）。其cDNA序列全长3368bp，包括68bp的5’UTR，1569bp的3’UTR和

8、1731bp的开放阅读框，共编码576个氨基酸。利用基因步移技术扩增HSP60基因启动子区域序列并测序，获得HSP60基因启动子区域序列1236bp，使用AliBata2.1软件预测出该区域I摘要包含2个TATA盒，4个CCAAT盒，3个热激元件。通过比对10个扇贝启动子序列，并未发现了假定的SNP位点。基于氨基酸序列构建的系统进化树与传统物种进化规律基本吻合。通过实时PCR检测发现HSP60在虾夷扇贝各组织中均有表达，升温后肾脏中该基因的转录量升高极显著，而肝胰腺、