坦布苏病毒ah-f10株e蛋白的原核表达及荧光定量pcr检测方法的建立

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1、分类号：１Ｓ８巧．６：０３６４单位代码１２７２０２４密级：学号：５签傲店狂乂ｆ学位论文坦布苏病毒ＡＨ－Ｆ１０株Ｅ蛋白的原核表达及萊光定量ＰＣＲ检测方法的建立Ｖ－ＴｈｅＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴｅｍｂｕｓｕｉｒｕｓＡＨＦ１０ＳｔｒａｉｎＥａｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｕａｎｔｈａ付ｖｅＲＴ－ＰＣＲＧｅｎｅｎｄＥｓｔａｂＦｈｉｏｒｅｓｃ畑ｃｅＱＭｅｔｈｏｄ研究生；王楠楠指导教师；王桂军教授合作指导教师：刘

2、光清研究员申请学位口类级别：农学硕：ｉｒ专业名称；预防兽民学研究方向：动物传染病所在学院：动物科巧学院答辩委贵会主席：２０１５年５月独创性声明本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作。１＾据我所知：＾标注及取得的研究成果，除了文中特别加和致谢的地方夕ｈ论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明

3、并表示谢意。学位论文作者签名：支轉锦签字日期：年月曰学位论文版权使用授权书徽农业、本学位论文作者完全了解大学有关保使学位论文安留用，论文的规定有权留向国家有关部口或构送的复印件和电子保并机交，论文被查大文件允许阅和借阅。本人授权安徽农业学可Ｗ将学位论全部或部分索，《中国论文的内容编入有关数据库进行检收录到学位、》，可、缩存编文全文数据库采用影印印或扫描等复制手段保汇学位论文，向社会公众提供信息服。（保密的学位论文在解密后适务）。用本授权书学名：王指导教签名：位论文作者

4、签师举璋：年：签期签日期月字日月日字年日：学位论文作者毕业后去向工：作单位：电话：通信地址：邮编AnhuiAgriculturalUniversityMasterDissertationTheProkaryoticExpressionofTembusuVirusAH-F10StrainEGeneandEstablishmentofFluorescenceQuantitativeRT-PCRMethodCandidate：WangNannanSupervisor：ProfessorWan

5、gGuijunProfessorLiuGuangqingAcademicDegreeappliedfor：MasterofAgricultureMajor：PreventiveVeterinaryMedicineDirection：AnimalInfectiousDiseaseCollege：CollegeofAnimalScienceandTechnologyMay,2015摘要坦布苏病毒病是由坦布苏病毒（Tembusuvirus）引起的，该病能导致蛋鸭的产蛋下降、生长迟缓以及死亡，同时该病毒对肉鸭及蛋鸭都有致病力

6、，鸭子感染后，临床出现高热、沉郁、厌食等症状；蛋鸭、种鸭的产蛋量开始下降而且下降比较迅速直到蛋鸭、种鸭不产蛋；肉鸭出现生长迟缓。坦布苏病毒病的发病率最高可以达100%，死亡率在5%-10%之间。坦布苏病毒的E蛋白含有病毒的抗原决定簇，构成坦布苏病毒的主要抗原表为，而且在病毒的吸附以及病毒侵入宿主细胞的过程中都起着重要的作用。本研究用RT-PCR检测方法来扩增Tembusu的E基因，然后连接到原核表达载体pET-32a（+），转化入大肠杆菌BL21细胞能成功表达重组蛋白His-E。蛋白大小为54kDa，表达的产物以存在

7、与沉淀中，具体是在包涵体中。Westernblot结果表明目的蛋白可与坦布苏病毒鸭的阳性血清发生特异性反应，表明表达的重组蛋白具有良好的反应原性。利用包涵体粗纯化的方法得到的高纯度的重组蛋白，用紫外分光吸收法测定其浓度为2.978g/L。对纯化后的目的蛋白进行乳化，乳化的方法是与弗氏佐剂等体积震荡，然后每只BALB/c小鼠注射0.2mg重组蛋白的剂量，进行背部皮下多点注射，每隔两周免疫一次，3免后，可加强免疫，眼眶取血，分离血清。以该血清作为一抗开展IFA实验。结果表明，坦布苏病毒在感染BHK-21细胞36h后，用倒

8、置荧光显微镜可以看到实验孔有特异性的绿色荧光，而对照组细胞无绿色荧光，表明表达纯化的E蛋白具有良好的免疫原性。根据TembusuvirusE基因序列，利用Primer5.0软件设计1对特异性引物，对E基因进行PCR扩增，然后将纯化回收的产物连接到pMD19-T载体，构建重组质粒pMD-19-E。然后对重组质粒进行PCR、酶切及测序鉴定，将阳性质