蚕丝作为软骨组织工程支架材料实验的研究

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1、●■复日大学硕P毕业论文盘丝作为软骨纽织T程支絮材}l的实验研冗蚕丝作为软骨组织工程支架材料的实验研究中文摘要目的：进一步证实蚕丝具有良好的生物相容性；观察蚕丝的体内降解过程；探讨钙盐溶解对蚕丝降解性的影响；比较微溶蚕丝、切割蚕丝与PGA在细胞黏附性方面的差异；探讨用蚕丝作为组织工程支架体外构建软骨的可行性。方法：实验分三个部分：第一部分蚕丝生物相容性及降解性研究，将脱胶后的蚕丝在CaCl。．H：0(摩尔比1：8)溶液中按不同时间进行溶解，沉淀于直径lOmm培养皿底部自然干燥呈圆盘状，剪刀剪成数块3×5Ⅱ船2大小薄片。取实

2、验用昆明小鼠54只，随机分为：cacl2处理20min组；cad：处理60min组；未处理组，每组18只，每只小鼠背部皮下埋植3块材料。埋植术后1月、2月、3月、4月、6月、8月，每组各处死小鼠2只，取出材料。埋植术后12月，处死剩余小鼠。行大体观察、组织学切片观察蚕丝的降解情况、降解产物对组织的影响及钙盐溶解对其降解性的影响。第二部分蚕丝与PGA的细胞黏附性比较研究，通过亲水性测试及扫描电镜观察切割蚕丝性能及结构变化，取新生兔关节软骨消化分离获取软骨细胞，体外培养扩增，将传至第3代细胞消化下来制成1X105／ml浓度单细

3、胞悬液，以每孔105个细胞(1m1)分别接种于微溶蚕丝材料和切割蚕丝材料及PGA材料上培养24h，然后通过细胞计数法及M1vr法作黏附细胞数检测，评价黏附率。第三部分蚕丝复合兔关节软骨细胞体外构建组织工程软骨，选新生兔关节软骨消化分离获取的原代软骨细胞为种子细胞，分别试用切割蚕丝及PGA为支架材料，采用体外培养4周构建组织工程软骨。通过倒置相差显微镜、扫描电镜、组织学及免疫学检测评价新生软骨。结果：第一部分蚕丝生物相容性及降解性研究结果：术后动物无不良反应，术区及邻近皮肤无红肿、水肿、破溃及异常隆起等。埋植术后1月、2月、

4、3月、4月时可见材料表面包裹一薄层纤维结缔组织，外形较植入时略有缩小。6个月时cacl2处理60mln组发现1块材料消失。8个月时cacl2处理20mln组有1块及cacl：处理60ran组有2块材料消失。12个月时分别有7块和9块消失。以上结果提示蚕丝已降解可能。组织病理学检查可见，最初几月各组均可见异物巨细胞排列于蚕丝周围，随月份增加逐渐减少，少见白细胞及淋巴细胞浸润。体内埋植2月后多数切片均可见蚕丝有裂解现象，cacl：处理60rain组较20min组出现早且明显。6个月的组织切片中可以观察到蚕丝局部结构消融现象。第

5、二部分蚕丝与PGA的细胞黏附性比较研究结果：经过切割处理，蚕丝亲水性明显增加，扫描电镜下可见经切割后蚕丝表面有更多的微丝剥脱，使得网孔增加、孔隙减小，丝与●t复巨大学硕{毕业论文盂丝作为软骨组织丁程支絮材料的卖验研究丝之间连接增加。细胞计数法测得微溶蚕丝、切割蚕丝及PGA三种材料黏附率分别为67．3％、84．2％、77．896，MTT法测得三种材料黏附率分别为68．3％、83．3％、77％。各组数据经方差分析，微溶蚕丝组与切割蚕丝组有统计学差异，切割蚕丝组与PGA组无统计学差异。第三部分蚕丝复合兔关节软骨细胞体外构建组织工

6、程软骨研究结果：倒置相差显微镜下见软骨细胞接种24h后单个或成团吸附在支架纤维表面或密布于纤维孔隙中。培养5天时，可见大部分纤维上均有细胞缠绕，纤维增粗。培养1周时外观有所增大，复合物密不透光。复合物培养2周时扫描电镜下观察，可见细胞呈多角状伸展开来，胞外基质分泌旺盛，黏附并包绕蚕丝纤维，成片状沉积覆盖于材料表面并进入支架内部。体外培养4周后，进行组织学检测，可见蚕丝构建的组织工程化软骨组织能形成近似于正常软骨的结构。免疫组化检测可见蚕丝构建的软骨组织中有被染成棕黄色的II型胶原。结论：(1)天然蚕丝具有良好的生物相容性，

7、脱去丝胶后埋植皮下1月后少见急性炎症细胞浸润。(2)蚕丝体内1年左右可以降解，降解产物不产生炎症反应。(3)经过钙盐溶解处理后降解时间加快，溶解20分钟与60分钟在降解率方面比较无统计学差异，而20分钟微溶解对蚕丝结构性能影响较小，更适合用作组织工程支架材料。(4)切割蚕丝具有良好的亲水性和细胞黏附性，细胞黏附率较未切割组相比较有统计学差异；和PGA相比无统计学差异(5)切割蚕丝纤维制作的支架能够维持软骨细胞立体培养的三维环境条件。孔隙大小适中，利于细胞进入材料内部。(6)软骨细胞在蚕丝支架上生长旺盛，分泌大量基质，连成片

8、状。(7)体外构建4周可见软骨样组织形成。关键词：蚕丝软骨细胞细胞培养组织工程支架材料2●一复旦大学硕j毕业论文蚤丝作为软骨组织工程支絮材料的实验研究Car打TageTissueEngineeringAbstractPurpose：1)Tofurtherconfirmthegoodblocompatlb