应用免疫磁珠分离及lamp技术快速检测配方奶粉中克罗诺杆菌

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1、南方医科大学2009级博士学位论文应用免疫磁珠分离及LAⅧ技术快速检测配方奶粉中克罗诺杆菌DetectionandIdentificationof(拗刀拍口c纪，气移弘ininfantformulabyImmunomagneticSeparationandLAMPAssay课题来源：自选学位申请人覃昱导师姓名罗炳德专业名称营养与食品卫生学培养类型全日制培养层次博士所在学院公共卫生与热带医学学院答辩委员会主席吴中海教授答辩委员会委员王斌会教授高永堂副教授郭遂群教授李华教授陈雪梅教授2014年3月23日广州ⅢII}IIⅧ洲洲

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4、』Y2618034应用免疫磁珠分离及LAMP技术快速检测配方奶粉中克罗诺杆菌博士研究生：覃昱指导老师：罗炳德教授一、研究背景和目的摘要克罗诺杆菌(cm力oIj口cr盯spp，)是一种重要的新型食源性致病菌，是囊括了原来所有阪崎肠杆菌(E聆fe加6Ⅱc饱rs口勉确i)的新属，该属的细菌是人和动物肠道内寄生的一种有周生鞭毛，能运动，兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。该菌呈世界性分布，主要通过婴幼儿配方奶粉经消化道感染儿童，引起新生儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎，甚或遗留神经系统后遗症或导致死亡。自1961年首次报

5、道由克罗诺杆菌引起的两例脑膜炎病例，随后在全球范围内相继出现了由该菌引起的疾病报道。2001年4月，在美国某医院新生儿重症监护室一早产儿发烧、心动过速，脑脊液培养发现克罗诺杆菌，诊断为脑膜炎，用抗生素治疗无效，9d后死亡。扩大检查该院49名婴儿的粪便和尿液，发现10人为阪崎肠杆菌阳性，其原冈是使用了某批Portagen的婴儿配方奶粉。而且在该批奶粉中也检查出了克罗诺杆菌，结果导致Ponagen婴儿配方奶粉于2002年4月被召回。1998年，在比利时有12名婴儿因哺喂同一牌号的婴儿配方奶粉而发生小肠结肠炎坏死。在这些婴儿的

6、粪便和该批奶粉中同时分离出克罗诺杆菌，当该批奶粉停用后，未有新的病例发生。2004年安徽阜阳劣质婴儿配方奶粉事件【I引起我国政府的高度重视，并且首次从87份婴儿配方奶粉中分离到1l株该菌，检出率达12．16％。尽管专家目前认为是由于奶粉的营养比例问题导致小孩畸形和死亡，但是从生病小孩的临床症状看，小孩头部肿大和反应迟钝与克罗诺杆菌感染的症状相似，可能该菌在致病中起到重要作用。近期研究表明，克罗诺杆菌是一种广泛存在的微生物，不仅能够存在于污染的食品和食品工厂当中，而且在几乎所有的环境中均能够分离得到。到目前为止已从奶酪、猪

7、肉、蔬菜、谷类、草药、香辛料，和经过UHT灭菌的牛奶等食品中分离出克罗诺杆菌。克罗诺杆菌致死率为10～80％，但是作为一种条件性致病菌，对新生儿具有更为严重的危害性，其严重威胁到公共卫生安全和人类健康。目前，针对克罗诺杆菌的检测方法主要有FDA推荐的分离培养、生化及血清学鉴定、免疫学方法和PCR。传统的检测和定量方法主要是采用选择性培养基，通过增菌和选择培养来实现，但其中主要存在三大问题，一是通常情况下，致病菌在食品检测样品中的量很少，在样品处理和榆测中容易出现人为的差错；二是非常繁琐和耗时，检测速度慢，通常需要6d以上

8、；三是许多致病菌在常规检测中属难培养或不可培养微生物，灵敏度较低；免疫学方法的特异性和灵敏度均较低：PCR法敏感、准确、快速，可替代传统检测方法，但由于需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程，以及对检测人员较高的技术要求，而使其难以在基层单位推广和普及。因此，建立一种特异富集、快速、简便、准确的检测方法，对克罗诺杆菌感染的流行病学调查和防治工作十分重要。l、样品富集技术——免疫磁珠分离法(immunomagneticseparation，IMS)生物样品往往是复杂的混合物，除少数特殊样品外，不能直接用于检测，因此需要进行样品

9、前处理这一重要步骤。传统的样品处理方法是从样品中分离目的微生物，通常使用选择性培养基来获得单个纯化的目的微生物。如果对于受到损伤的和热应激微生物还需经过增菌培养，增菌过程应包括前增菌、选择性增菌和后增菌，因此从样品中检测病原微生物需很长的时间，而实际检测时间主要是等待增菌的时间，这样就远远不能适应快速检测的需要。由于免疫磁珠分离法能特异性吸附目的细菌，受到了不少学者的关注。免疫磁珠是由直径3～5微米，有一定磁性，且分散度良好的微珠经不同单克隆抗体包被面成的颗粒，而免疫磁珠分离方法是于70年代中期发展起来的一项免疫学技术，

10、其分离原理是通过磁珠表面包被的细胞特异性抗体与细胞表面标记分子问特异结合．使抗原阳性细胞与抗原阴性细胞相分离，具备了同相化试剂特有的优点以及免疫学反应的高度专一性，被广泛应用于多种血液细胞的分离，蛋白质的纯化，以及对食品、水、生物样品、环境等标本中病原微生物的分离和检测工作中，显示出良好的开发应用前景。IMs用于微生