六个小麦抗叶锈病近等基因系mrna表达差异研究

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1、六个小麦抗叶锈病近等基冈系mRNA表达差异研究(mRNAdifferentialdisplayreverse咖s谢州onPCRDDRT-PCR)p41、eDNA代表性差异分析(eDNArepresentationaldifferenceanalysis，eDNA．RDA)【巧J、若减杂交(subtrantivehybridization，SH)、抑制消减杂交(suppressionsubtractivehybridization。SSH)口州和eDNA-AFLP(complementaryDNAamplifiedfragmentslengthpolymorphism)p¨

2、。eDNA-AFLP作为新的mRNA指纹图谱技术，可用于研究样本间mRNA水平基因的表达差异，可以筛选大量不同表达的eDNA片段，进而分离大量特异表达的基因。因此，利用eDNA-AFLP进行基冈差异表达、表达基因遗传连锁作图和基因克隆等方面研究具有广阔的应用前景。1．3eDNA．AFLP的基本原理及其研究进展eDNA-AFLP技术是Bachem等177J以AFLP为基础发明的用于mRNA差异表达分析方法，它结合了RT-PCR和AFLP技术。其基本原理是：从总RNA中纯化出mRNA作为模板，通过逆转录酶反转录合成eDNA第l链，在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下，用置换法合成

3、eDNA第2链。得到双链eDNA后用识别序列分别为6个碱基和4个碱基的2种限制性内切酶进行酶切。其中识别6个碱基的为稀有切点酶(rarecutter)，识别4个碱基的为常见切点酶(frequentcutter)，要达到的理想效果，前者对于系统中每一种eDNA应该只切1次，而后者在前者切点的临近位置进行切割，使产生100bp至1000bp长度的片段，以便被测序胶可以有效地分辨。酶切后添加双链锚定接头，使酶切后的片段与接头相连接，产生初级扩增模板，再加入与接头序列互补的预扩增引物进行预扩增，产生次级扩增模板。预扩增过程可为后来进一步的选择性扩增提供了大量的次级扩增模板，这也是

4、cDNA-AFLP只需要很少量的起始材料(大约为100"---200rag)即可进行扩增的原因。在选择性扩增阶段，使用比预扩增引物添加l至多个碱基的引物有选择的扩增限制性片段，扩增的产物TDF通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，从电泳图谱中找出差异表达的片段。cDNA-AFLP技术保留了AFLP多态性丰富、稳定性高、无需了解序列信息等优点的同时，集中显示基因组表达序列的多态性差异；重复性好、准确可靠、效率高【78q”可对生物体转录组进行全面、系统的分析；并且获得的转录衍生片段(transeript-derivedfragments，TDr)一般也集中在蛋白的编码区或者附近，可最人

5、限度的提供基因编码区的信息。cDNA舰P所需的实验仪器设备也比较简单，已经成为目前筛选差异表达基因最有效的方法。目前，该技术已成功地应刚丁植物胚胎发育刚、形态发生【83】、果实发育‘叫、信号转导【8卯、植物抗热删、抗盐【871、抗冷【88】、抗旱【s9l、抗病性【螂，以及植物与真菌互作有关的基因的比较鉴定与克隆19ll。目前，该技术已广泛虑用于马铃薯【92,931、玉米【941、小麦[95．96]、水稻[97,98】、棉花【991、菊苣‘1删、大豆【101】、黄豆fl021、豌豆【i031、甜菜n041、烟草【1051、藜属植物11蚓等作物的差异表达研究，克隆和分离出多个

6、有价值的基冈，并且该技术在鉴定野生菌种的致病性中也有应用11071。QiIl等开发的计算机程序GenEST使得eDNA．AFLP与已知的EST(expressedsequencetag)序列有效的结合起来，已经成为分离差异表达基因并在此基础上进行深入的基因功能分析的新工具。eDNA．AFLP作为一种分子生物学技术方法，已经成为研究差异表达基因的重要工具，并逐渐显示出它在基因功能的全面分析上的巨大应用价值。有理由相信，eDNA．AFLP必将在后基因组时代发挥更大的作用，成为促进生命科学发展的新动力。3河北农业大学硕士学位(毕业)论文1．4研究意义小麦抗叶锈病基因Lr9、Lr

7、l5、Lrl9、Lr25、Lr38和Lr45分别来源于小伞山羊草、普通小麦Kenya、长穗偃麦草、黑麦、中间偃麦草和日本小黑麦的杂交后代，分别位于6BL、2D、7DL、4AB、2AL和2AS染色体上，对我国的小麦叶锈菌具有很强的抗叶锈性。小麦抗叶锈病基因Lr9，Lrl5，Lrl9，Lr25，￡r38，Lr45均是在小麦苗期即开始表达的抗叶锈基因，抗感表现型比较明显，从而便于分离小麦抗叶锈病近等基因系之间的基因表达差异。为明确上述六个基因与小麦叶锈菌互作的分子特性，本试验以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr9、TcLrl5、TcLr