产气荚膜梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制及初步应用

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1、山东农业大学硕士学位论文产气荚膜梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制及初步应用姓名：刘晓敏申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：柴同杰20120612山东农业人学硕：卜学位论文产气荚膜梭菌仅毒素快速诊断金标试纸条的研制及初步应用中文摘要产气荚膜梭菌(C1．pemingens)是一种广泛分布于自然界中的条件性致病菌，其引起的家畜“猝死症”发病急，死亡快，发病率和死亡率高，给养殖业的发展带来了巨大的经济损失。0【毒素是产气荚膜梭菌最重要的毒力因子，各型产气荚膜梭菌均可产生0【毒素。目前，对家畜产气荚膜梭菌感染的诊断主要依赖于常规实验室诊断，但其操作过程复杂、耗时长，不适用于该疫病

2、的防控。因此，建立一种针对0【毒素快速准确的诊断方法，并能应用于现场的快速诊断是十分必要的。本实验首先采用分子生物学方法获得Q毒素表达质粒：用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，利用IPTG诱导表达，摸索最优表达条件；表达产物经SDS—PAGE电泳，获得大小为45KD的融合蛋白；在最佳条件下大量诱导表达目的蛋白，镍柱亲和纯化目的蛋白，Westemblot检测表明目的蛋白具有良好的免疫学活性。用表达纯化后的Q毒素蛋白作为抗原免疫家兔，四免后15d取血清获得多克隆抗体。经ELISA方法检测抗体效价可以达到l：512000，显示了良好的特异性。采用硫酸铵沉淀法和透析袋纯化抗体。胶

3、体金免疫层析技术具有快速简便、准确直观等优点，具有良好的特异性和敏感性，是目自仃现场应用最广泛的一种诊断方法。本实验用抗产气荚膜梭菌c【毒素多克隆抗体为探针制备了产气荚膜梭茵a毒素快速诊断金标试纸条。利用柠檬酸三钠还原法制备了粒径为40nm的胶体金，然后用其标记抗a毒素多克隆抗体喷涂金标垫，同时用纯化的c【毒素多克隆抗体和羊抗兔IgG二抗包被M135硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线，与金标挚组装成试纸条。对试纸条的特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的产气荚膜梭菌0【毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测，并比较其与PCR检测结果的符合率。‘’结果显示，成功制备了0

4、L毒素快速诊断金标试纸条，金标垫上最佳抗体包被量为lm咖L；检测线上O【毒素多克隆抗体最适印迹量约为600“g／mL；控制线上羊抗兔二抗的最佳包被浓度为1：20稀释；当仅毒素质量浓度为2．80和1．40mg／mL时，检测线处产气灭膜梭菌。毒索十J{速诊断金标试纸条的研制及初步应用有明显条带：当c【毒素质量浓度为0．70nlg／mL时检测线处条带较淡：当O【毒素质量浓度为0-35mg／mL时，检测线处几乎没有条带，表明试纸条具有较好的敏感性和特异性；研制的试纸条仅与产气荚膜梭菌G【毒素发生反应，且不同批次的试纸条重复检测结果无差异，表明试纸条具有较高的特异性和重复性：该试纸条最低可

5、检测1．40mg／mL的毒素量，与PCR方法的符合率为80．00％，基本能满足要求，具有良好的应用前景。关键词：产气荚膜梭菌；猝死症；仅毒素；多克隆抗体；胶体金；免疫层析试纸条；快速现场诊断。山东农业大学颂二}=学位论文ResearchandtentatiVeapplicationofthecolloidalgoldteststripf．0rdetectionoftheClostridiumperfringens仅toxinAbstract(一DJ，rf讲甜，”per毹ngensisaconditionalpathogenswidelydistributedinnature，th

6、e“suddendeath’’whichcausedbyC10stridiumpeI。fringensoutbreaksanddeathsquicklywithhi曲morbiditya11dmortality，andithadmadeagreatdamagetotllea11imalhusballdrydevelopmIellt．AlpHatoxinisthemostimportantVimlencefactorofClostridiumpe矗HngensandeachtypeofClostridiumper衔ngenscanproduceQtoxin．Atpresent，th

7、ediagIlosisof0ltoxinismainlydependentonconVentionallaboratorydiagnosis，butithaSmaJlyshoncomingssuchast11eoperationiscomplex，time—consumingaIldrequiresexpensiVeequipment．Therefore，anewprocess嘶tllhighsensitiVityandspecificitytodetect0【toxinandc