强光胁迫下外源硫化氢对石斛抗氧化系统影响及msap分析

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1、摘要铁皮石斛，是我国传统的贵重中药材，为兰科多年生附生草本植物。石斛是兼性[1]CAM植物，其生长对生态环境要求十分严格，对光强变化较为敏感。本试验以铁皮石斛为材料，研究强光胁迫下外源H2S对其叶绿素荧光和抗氧化酶活性的影响，探讨H2S对兼性CAM植物的生理调节功能；并利用甲基化敏感扩增多态性技术，研究胁迫前后与H2S介导缓解胁迫前后甲基化水平及状态的变化，探讨铁皮石斛在强光胁迫下生理相应机制，以及外源H2S调控铁皮石斛响应强光、缓解逆境胁迫的分子机理。主要研究结果如下：(1)硫氢化钠（NaHS，H2S的供体）处理缓解强光胁迫对铁皮石斛造成的氧化损伤作-1用有显著的剂量效应。

2、200μmol•L的H2S处理可显著促进SOD、CAT和POD的酶活性，降低MDA含量，缓解强光胁迫对铁皮石斛造成的氧化损伤作用。高浓度-1(600μmol•L)H2S处理则加重了石斛的氧化损伤。-1-1(2)200μmol•LH2S处理可缓解强光下石斛Fv/Fm的下降程度；高浓度(600μmol•L)H2S处理加剧了Fv/Fm的下降程度，光能转换系统未能通过有效的光能转换和非光化学反应耗散过剩的光能,从而加剧了PSⅡ反应中心光抑制的发生。(3)采用66对MSAP引物进行PCR扩增反应，平均共扩增出1193.5个带型，平均每对引物扩增出18.1个片段。不同浓度H2S的处理总甲

3、基化和全甲基化的比率不同。DNA甲基化的总体水平为28.9%-35.4%,全甲基化水平为19.9%-23.9%。其中-1200μmol•L的NaHS处理的石斛DNA甲基化比率为33%，最接近于对照（35.4%）。-2-1-1(4)采用66对引物组合进行MSAP扩增发现：800μmol·m·s强光下0μmol•LH2S-1-1处理组T1与对照CK相比、200μmol•LH2S处理组T3和600μmol·LH2S处理组T5与T1相比，石斛基因组DNA去甲基化（B型）位点数分别为75、93和78，占总甲基化多态性扩增位点数的6.4%、7.7%和6.7%。类型C包含了5种甲基化带型，

4、表明强光胁迫下外源H2S对铁皮石斛基因组DNA发生了甲基化水平的增加。T1、T3和T5的石斛基因组DNA甲基化（C型）位点数分别为106、99和107，占总甲基化多态性扩增位点数的9.0%、8.1%和9.2%。H2S处理组T3和T5分别与对照相比，分别有8.1%和8.8%的位点DNA甲基化水平上升。类型D的比例少于总检测位点的1%。(5)采用66对引物组合共筛选得到200-500bp左右的多态性片段有37条，对其中变化稳定的11个片段进行测序，有1条发生了超甲基化，占9%；3条发生了甲基化，占27%；还有7条发生了去甲基化，占64%。对这11个多态性片段进行了克隆、测序和序列

5、分析。其中有6条片段（Seq1、Seq2、Seq3、Seq5、Seq8、Seq9）与光合作用有关的ATP合成酶、抗核苷酸内焦磷酸酶/磷酸二酯酶基因合成、抗逆I基因转录因子等有一定的同源性。序列分析表明Seq2是一种MYB转录因子，它们广泛参与与植物次生代谢的调控、对激素及环境因子的应答，可能参与细胞周期的调控和调节细胞的分化，从而在植物胁迫应答过程中起着重要的调控作用。Seq9是AP2转录因子，可能调控植物多种基因的表达从而调节植物强光的分子应答反应，能有效提高作物对逆境胁迫的耐受力。Seq5、Seq8分别是ATP合成酶基因和ATP结合蛋白，它们的去甲基化可能诱导基因的表达，

6、参与氧化磷酸化和光合磷酸化作用，缓解强光对石斛的损伤。推测H2S可能通过调控这些转录因子与功能基因的甲基化状态，从而引起了基因表达的变化，产生或启动对强光胁迫的适应机制，缓解强光胁迫下石斛的氧化损伤。关键词：铁皮石斛，H2S，强光胁迫，DNA甲基化，甲基化敏感扩增多态性IIAbstractDendrobiumofficinaleisaOrchidperennialherbaceousplantandantraditional[1]valuableherbalmedicineofChinese.DendrobiumofficinaleisfacultativeCAMplants

7、,Itsgrowthisverystrictontheecologicalenvironment,andrelativelysensitiveonlightintensitychanges.TheeffectsofsodiumhydrosulfideonthechlorophyllfluorescenceandantioxidantsystemofDendrobiumofficinaleunderhighlightstresswerestudied,investigatedphysiologicalre